J. Agric. Sci. and Biotechnol.

ISSN: 23020-113

Vol. 6, No. 1, Juli 2017

KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN FILOGENI LALAT BUAH Bactrocera occipitalis (Diptera:Tephritidae) DARI TARAKAN BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA GEN COI

Dwi Martiningsia, I Nyoman Wijaya, dan I Putu Sudiarta*)

Program Magister Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana

*) Corresponding author at : Jl. PB. Sudirman Denpasar Bali Indonesia E-mail : [email protected]

Abstract

Bactrocera occipitalis is one species of group B. dorsalis complex. The main host of B. occipitalis is mango (Mangifera indica), guava (Psidium guajava), orange (Citrus sp), sapodilla (Achras zapota) and star fruit (carambola Averrhoa). Region of distribution B. occipitalis are Philippines, East Malaysia (Sabah), Brunei, Indonesia (Kalimantan). B. dorsalis complex has similar morphological and have a less distinctive character for taxonomic identification at immature life stages, it will be an obstacle for the export of fruit and vegetables from Indonesia related to quarantine the country of destination, and DNA-based barcode can solve this problem. Molecular Identification B. occipitalis Tarakan successfully amplified at 642 bp with COI gene. Based on sequence homology COI B. occipitalis Tarakan has a high of similarity with B. occipitalis Philippines is 99.4% -100%. The phylogenetic analysis of DNA sequences and genetic distance based on COI gene sequences showing too genetic closeness with B. occipitalis Philippines.

Keywords : Bactrocera occipitalis, COI gene

  • 1.    Pendahuluan

Lalat buah merupakan salah satu hama hortikultura yang paling merusak di dunia dan menimbulkan risiko bagi kebanyakan buah komersial dan sayuran (Allwood et al., 1999; Clarke et al., 2005). Hal ini memiliki implikasi besar untuk produksi yang berkelanjutan dan akses pasar. Di seluruh dunia ada sekitar 4000 spesies lalat buah yang termasuk family Tephritidae dan sekitar 350 spesies merupakan organisme penggangu tumbuhan yang menyebabkan kerugian ekonomi (Plant Health Australia, 2011).

Lalat buah Bactrocera dorsalis komplek adalah hama polifag dan sangat invasif sehingga merupakan spesies hama penting dalam pertanian (Stephens et al., 2007; Advasakulchai et al., 1999). Lalat buah B. dorsalis secara signifikan menyebabkan kerugian ekonomi, kerusakan buah, penurunan produksi buah dan hilangnya pasar ekspor yang terkait dengan pembatasan karantina (Peterson et al., 1998 dalam Wan et al., 2011). Bactrocera occipitalis merupakan salah satu spesies B. dorsalis komplek (Clarke et al., 2005; Delomen et al., 2013; Plant

Health Australia, 2011). Inang utama dari B. occipitalis adalah mangga (Mangifera indica), jambu (Psidium guajava), jeruk (Citrus sp) (Clarke et al., 2005; Delomen et al., 2013; Yu et al., 2005; Allwood et al., 1999). Menurut Pujiastuti et al., 2009 dan Permentan no. 93/Kpts/H.k.060/12/2011 bahwa sawo (Achras zapota) dan belimbing (Averrhoa carambola) juga merupakan inang B. occipitalis.

Daerah sebar B. occipitalis menurut Drew, 2010 meliputi Filipina, Malaysia Timur (Sabah), Brunei, Indonesia (Kalimantan). Berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian no. 93/Kpts/Hk.060/12/2011 tentang jenis-jenis OPTK (B. occipitalis merupakan OPTK A2) yang artinya B. occipitalis ada di Indonesia tetapi masih di daerah yang terbatas yaitu di Kalimantan, Jawa Barat (Bogor), dan Sumatera (Tanjung Balai Karimun).

  • B.    dorsalis kompleks memiliki morfologis serupa dan pada tahap perkembangan awal memiliki karakter yang kurang khas untuk identifikasi taksonomi, barcode berbasis DNA bisa memecahkan masalah ini (Frey et al., 2013). Barcoding DNA secara bertahap merupakan alat yang efektif untuk mengidentifikasi spesies dalam kisaran yang luas pada grup taksonomi, dan beberapa publikasi melaporkan bahwa penanda DNA rata–rata efektif dan cepat untuk identifikasi lalat buah (Jiang et al., 2014). Diagnosis secara genetik dengan mtCOI dan 16 s DNA dapat membedakan secara spesifik antara spesies B. occipitalis dan B. philipinensis. Deteksi dan identifikasi dengan menggunakan Polimerase Chain Reaction ( PCR) dengan primer spesifik yang dirancang berdasarkan Mitokondria sitokrom oksidase I (COI) telah dilakukan dan menghasilkan hasil deteksi yang cepat dan spesifik (Yu et al., 2005).

Keberadaan B. occipitalis di Indonesia akan menjadi kendala bagi ekspor buah dan sayur dari Indonesia terkait dengan perkarantinaan negara tujuan hal ini juga didukung oleh Siwi, et al., 2006 bahwa peraturan karantina dari negara pengimpor dapat mengembargo produk ekspor dari negara yang terdapat hama lalat buah tertentu atau memaksa produsen untuk memberi perlakuan khusus yang akan banyak memakan biaya. Walaupun demikian Indonesia merupakan negara kepulauan yang akan menjadi barier bagi penyebaran lalat buah B. occipitalis. Maka dari itu perlu dipelajari kaerakteristik dan filogeni molekuler B. occipitalis dari Tarakan yang mewakili Kalimantan sebagai daerah sebar B. occipitalis.

  • 2.    Bahan dan Metode

    • 2.1 . Pengambilan sampel

Sampel B. occipitalis didapat dari Balai Karantina Pertanian Kelas I Tarakan Kalimantan Utara. Identifikasi dilaksanakan di Laboratorium Entomologi dan Biomolekuler Karantina Tumbuhan Balai Karantina Pertanian Kelas I Denpasar mulai Februari 2015 – Juni 2015

  • 2.2    Identifikasi molekuler

Identifikasi molekuler menggunakan metode PCR yang diawali dengan melakukan ekstraksi DNA dari sampel B. occipitalis dari Tarakan. Primer yang digunakan yaitu gen mtCOI spesifik lalat buah. Produk PCR kemudian dielekroforesis dan kemudian di sekuensing

  • 2.3    Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA sampel lalat buah B. occipitalis menggunakan Qiagen Dneasy (Qiagen, Hilden, Germany) Blood and Tissue kits. Sampel B. occipitalis diambil bagian kepala, thorax, dan tungkai kemudian digerus menggunakan pistil dan mortar, dibantu dengan penambahan nitrogen cair. Serbuk hasil gerusan dimasukkan ke tube microcentrifuge 1,5 ml, ditambahkan 180 µl Buffer ATL dan 20 µl proteinase K kemudian di mix dengan vortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 56ºC di thermomixer overnight. Selanjutnya ditambahkan 200 µl Buffer AL pada sampel, dan di vortex lagi. Setelah itu sitambahkan 200 µl ethanol (96100%), dan divortex lagi. Selanjutnya campuran tersebut dimasukkan ke Dneasy Mini Spin column dalam tabung koleksi 2 ml dengan menggunakan pipet, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit, larutan yang masuk ke tabung dibuang. Selanjutnya Dneasy Mini Spin column dipindah ke tabung koleksi 2 ml yang baru, ditambahkan 500 µl Buffer AW 1, dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit, larutan yang masuk ketabung dibuang. Selanjutnya Dneasy Mini Spin column dipindahkan lagi ke tabung koleksi 2 ml yang baru,ditambahkan 500 µl Buffer AW2, dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit sampai membran Dneasy kering, larutan yang ada ditabung dibuang. Selanjutnya Dneasy Mini spin coloumn dipindahkan ke tabung microcentrifugasi 2 ml yang bersih, dan pipet 200 µl Buffer AE langsung ke membran DNeasy. Kemudian inkubasi pada temperatur ruang selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm selama1 menit untuk elusi.

  • 2.4    Polymerese Chain Reaction (PCR)

Hasil Ekstraksi DNA kemudian diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang spesifik yang didesain dari Gen Mitrocondria Cytochrome Oxidase I Fruit Fly CO1-F(FFCOI)5’-GGAGCATTAATYGGRGAYG-3’ dan primer reverse HCO-R5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ (Plant Health Australia, 2011). PCR dilakukan dalam volume 25µl yang terdiri dari master mix 12,5 µl (1x BSA, 10x Buffer, dNTP’s, MgCl2, dan NEB Taq), 1 µl LCO1490-F, 1 µl HCO-R, DNA template 3 µl, dan Nuclease free water 7,5 µl. Siklus PCR yang digunakan yaitu predenaturasi 94ºC selama 2 menit, kemudian dilanjutkan 40 siklusyang terdiri dari denaturasi pada suhu 94ºC selama 30 detik, annealing (penempelan primer) pada 52 ºC selama 30 detik, ekstensi 72 ºC selama 30 detik, dan ekstensi akhir 72 ºC selama 2 menit.

  • 2.5    Elektroforesis dan Sekuensing

Produk PCR 1µl (ditambah 1 µl loading dye) dielektroforesis dalam gel agarose 2%. Gel agarose 2% dipilih karena panjang DNA dari B. occipitalis berkisar 556-642 pb (Delomet et al., 2013, Pramudi et al., 2013). Gel agarose 2% digunakan untuk fragmen panjang DNA 50-2.000 panjang basa (Holil, 2004) . Pembuatan 2% gel agarose dalam volume 80 ml 1x buffer TAE, maka jumlah agarose yang akan ditimbang yaitu: 2 gram/100ml x 80ml=1,6 gram. Agarose 1,6 gram ditempatkan ke dalam labu erlenmeyer dan isi dengan larutan 1X Buffer TAE sampai volume 80ml, kemudian dikocok sampai merata. Setelah itu dipanaskan dalam microwave sampai mendidih sampai larutan menjadi jernih. Kemudian agarose didinginkan kira-kira sampai 600C dan tambahkan 3µl biotine gel red dan campur hingga merata. Setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan pasang well-forming combs, ditunggu kurang lebih 30 menit atau sampai gel mengeras. Kemudian well-forming combs dilepas secara perlahan-lahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.

Elektroforesis dilakukan selama 120 menit pada 70 volt. DNA yang telah dielektroforesis divisualisasi dengan UV transluminator. Produk hasil PCR yang berhasil teramplifikasi dikirim ke laboratorium FirstBase Malaysia untuk dilakukan sekuen nukleotida, urutan basa nukleotida hasil sekuensing akan digunakan dalam analisis molokuler selanjutnya.

  • 2.6    Analisis sekuen dan Filogenetik

Hasil sekuen nukleotida B. occipitalis dari Tarakan berdasarkan gen COI digunakan untuk mencari gen B. occipitalis yang telah dipublikasikan di GenBank dengan Program Basic Local Aligment Tool (BLAST) yang dapat diakses pada www.ncbi.nlm.nih.gov. Sekuen B. occipitalis dari Tarakan dan sekuen-sekuen yang homolog berdasarkan GenBank tersebut selanjutnya dilakukan aligment dengan program ClustalW untuk mengetahui tingkat similaritas atau kesejajaran sekuen. Selanjutnya hasil aligment data sekeuen nukeotida digunakan untuk mengkontruksi pohon filogeny dengan menggunakan program Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) 6 (Tamura et al., 2013).

  • 3.    Hasil dan Pembahasan

Sampel B. occipitalis dari Tarakan dideteksi dengan menggunakan primer Mitocondrial cytochome C Oxidase I (COI) dengan metode PCR. Amplifikasi menggunakan pasangan primer COI, Fruit Fly CO1-F(FFCOI)5’-GGAGCATTAATYGGRGAYG-3’ dan primer reverse HCO-R5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ (Plant Health Australia, 2011) dengan panjang fragmen DNA yang diperoleh 642 bp (Gambar 1.).

Data sekuensing B. oocipitalis berdasarkan Gen COI dicari homologinya di GenBank dengan menggunakan sofware BLAST, ditemukan beberapa data sekuen asam nukleat spesies B. occipitalis dalam data GenBank yang memiliki

similaritas dengan B. occipitalis yang ditemukan di Tarakan. Data sekuen B.occipitalis di GenBank yang memiliki similaritas dengan data sekuen yang berasal dari Tarakan semuanya berasal dari Filipina. Kemudian dilakukan pensejajaran (aligment) sekuen B. occipitalis Tarakan dan sekuen yang similar dari GenBank dengan menggunakan ClustaW (Tabel 1.).

M 1

◄     642bp


600

500

400

300

200

100

Gambar 1. Hasil amplifikasi DNA 1. B. occipitalis Tarakan, dengan metode PCR menggunakan pasangan primer COI-F(FFCOI)5’ dan HCO-R5. Sampel B.occipitalis teramplifikasi dengan ukuran 642 pb. M : marker 100 bp (Fermentas)

Hasil pensejajaran sekuen menunjukkan bahwa asam nukleat gen COI B. occipitalis Tarakan menunjukkan homologi yaitu 99,4-100%, tertinggi dengan B.occipitalis yang berasal dari Filipina dengan nomer aksesi KC446105 Voucher Bd793 yakni sebesar 100 % (Tabel 1.).

Analisa filogenetika menggunakan metode unweighted pair group dengan rata-rata aritmatika (UPMGA) 1000x bootstrap (Brinkman, F and D.Leipe 2001; Dhramayanti, 2011; Holil, 2004; Tamura et al., 2013) diperoleh konstruksi filogeni Bactrocera occipitalis Tarakan dengan koleksi GenBank (Delomen et al., 2013) (Gambar 2. ).

Tabel 1. Tingkat homolog (%) B.occipitalis dari Tarakan, dan spesies B. occipitalis negara lain yang terdapat di GenBank berdasarkan gen COI

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10  11

[1]

ID

[2]

99,6

ID

[3]

99,8

99,8

ID

[4]

99,8

99,4

99,6

ID

[5]

99,6

99,2

99,4

99,4

ID

[6]

99,6

99,2

99,4

99,4

99,2

ID

[7]

100

99,6

99,8

99,8

99,6

99,6

ID

[8]

99,8

99,4

99,6

99,6

99,8

99,4

99,8

ID

[9]

99,4

99

99,2

99,2

99,4

99

99,4

99,6

ID

[10]

81,1

80,9

81,1

81,3

81,1

81,1

81,1

80,9

80,5

ID

[11]

85,1

84,7

84,9

85,3

85,3

85,1

85,1

85,1

85,1

80,9 ID

Bo KC446124 Filipina

30

Bo DQ116309 Filipina

28

Bo Tarakan

33

Bo KC446105 Filipina

Bo KC446117 Filipina

47

Bo KC446122 Filipina

99

Bo KC446110 Filipina

34

Bo KC446107 Filipina

Bo KC446111 Filipina

Anastrepha ludens

Ceratitis capitata

-----------------------------1-------------------------------------------------------1------------------------------------------------------1-------------------------------------------------------1-------------------------------------------------------1-------------------------------------------------------1------------------------------------------------------1 0.12        0.10        0.08        0.06        0.04        0.02        0.00

Gambar 2. Pohon Filogeni B. occipitalis Tarakan dibandingkan dengan B. occipitalis dari negara lain berdasarkan Gen COI. Nomor aksesi B. ocipitalis KC446122 Bd793 dari Filipina, B. ocipitalis KC446124 Bd 800 dari Filipina, B. ocipitalis KC446117 Bd 739 dari Filipina B. ocipitalis KC446107 Bd 783 dari Filipina, B. ocipitalis DQ116309 Isolat FF 1000 dari Filipina, B. ocipitalis KC446110 Bd786 dari Filipina, B. ocipitalis KC446111 Bd787 dari Filipina, B. ocipitalis KC446105 Voucher Bd739 dari Filipina Ceratitis capitata JN705013 dan Anasthrepa lugens HM538334 sebagai outgroup. Pohon Filogeni dikontruksi menggunakan perangkat MEGA versi 6.06 (Algoritma UPGMA dengan 1000 bootstap method Replication).

Berdasarkan analisa filogenetik B. occipitalis Tarakan berada satu clade dengan B. occipitalis Filipina, jadi berdasarkan gambar 2. B. occipitalis Tarakan berada pada kelompok monofiletik dengan B. occipitalis Filipina. Hasil filogenetik dengan UPGMA didukung dengan nilai bootstrap yang tinggi yaitu 99%, menurut Dharmayanti (2011) nilai bootstrap menjadi tolak ukur penentu tingkat kepercayaan filogeni. Analisa bootstrap adalah metode yang menguji seberapa baik set data model, menguji cabang-cabang yang dapat dipercaya.

Berdasarkan Jarak genetik sekuen gen COI B. occipitalis Tarakan dan Filipina sekitar 0,00-0,006. Jarak genetik terendah yaitu dengan B. occipitalis KC446105, KC446124 dan DQ 116309 Filipina yaitu 0,043, dengan B. occipitalis Tarakan memiliki jarak genetik 0,000, dan jarak genetik tertinggi dengan B.occipitalis KC446111 dari Filipina yaitu 0,006 (Tabel 2.). Spesies yang memiliki nilai jarak genetik semakin rendah, maka memiliki hubungan kekerabatan semakin dekat. Sebaliknya spesies yang memiliki jarak genetik tinggi, maka hubungan kekerabatannya semakin jauh (Dharmayanti 2011). Tetapi semua B. occipitalis tersebut berada dalam 1 clade yang sama.

Tabel 2. Matriks Jarak Genetik B. occipitalis Tarakan dan Filipina berdasarkan

Gen COI

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10    11

[1]

[2]

0,000

[3]

0,000

0,000

[4]

0,000

0,000

0,000

[5]

0,002

0,002

0,002

0,002

[6]

0,002

0,002

0,002

0,002

0,004

[7]

0,002

0,002

0,002

0,002

0,004

0,004

[8]

0,004

0,004

0,004

0,004

0,006

0,002

0,006

[9]

0,006

0,006

0,006

0,006

0,008

0,004

0,008

0,006

[10]

0,257

0,257

0,257

0,257

0,264

0,262

0,253

0,256

0,276

[11]

0,257

0,257

0,257

0,257

0,263

0,257

0,252

0,250

0,257

0,268

Keterangan :  [1] B. occipitalis Tarakan [2] B. occipitalis KC446105 Voucher

Bd739 Filipina [3] B. occipitalis KC446124 Filipina Voucher Bd 800 [4] B.occipitalis DQ 116309 Filipina [5] B. occipitalis KC446122 [6] B. occipitalis KC446110 [7] B. occipitalis KC446117 Voucher Bd739 Filipina [8] KC446107 Vouher Bd783 Filipina [9] B. occipitalis KC446111 [10] Ceratitis capitata JN705013 sebagai outgroup [11}.Anasthrepa lugens HM538334 sebagai outgroup

Daerah sebar B. occipitalis meliputi Filipina, Malaysia Timur (Sabah), Brunei, Indonesia (Kalimantan) (Drew and Romig, 2010. Inang utama lalat buah ini yaitu mangga (Mangifera indica), jambu (Psidium guajava), jeruk (Citrus sp), sawo (Achras zapota) dan belimbing (Averrhoa carambola) (Clarke et al., 2005; Delomen et al., 2013; Yu et al., 2005; Allwood et al., 1999; dan Pujiastuti et al., 2009). Kedekatan genetik berdasarkan sekuen gen COI B. occipitalis Kalimantan dan Filipina ini didukung oleh kesamaan faktor lingkungan dan tanaman inang.

Hal ini didukung oleh hasil penelitian Samie and Zaki (2011) yaitu analisis berdasarkan sekuen gen COI pada lima sekuen B. Zonata menunjukkan kesamaan dari lima lokasi yang memiliki kondisi lingkungan dan tanaman inang yang sama.

  • 4.    Simpulan

Identifikasi molekuler B. occipitalis Tarakan berhasil dilakukan dengan gen COI yaitu teramplifikasi pada 642 pb dan pada tingkat homologi sekuen COI B. occipitalis Tarakan memiliki tingkat similaritas yang tinggi dengan B occipitalis Filipina yaitu 99,4%-100%. Begitupula dengan analisa Filogenetik dan jarak genetik sekuen DNA berdasarkan sekuen gen COI menunjukkan kedekatan genetik dengan B. occipitalis Filipina.

Daftar Pustaka

Adsavakulchai, A., V. Baimai. W. Prachyabrued, P. J. Grote, S. Lertum. 1999.

Morphometric study for identification of The Bactrocera dorsalis complex (Diptera:threpitidae) using wing image analysis. Biotropia 13: 37-48.

Allwood, A.J., A. Chinajariyawong, R. A. I. Drew, D.L. Hancock, C Hengsawad, J. C. Jinapin, M. Jirasurat, C. Kong Krong, S. Kritsaneepaiboon, C.T.S. Leon, S. Vijaysegaran. 1999. Host Plant records for fruit Flies (Diptera Tephritidae) in South-East Asia. Raffles Bullet. Zool. (Suppl.7).

Boykin, L. M., M. K. Schutze, M. N. Krosch, A. Chomoic, T. A. Chapman, A. Englezou, K.F. Armastrong, A.R. Clarke, D. Hailstones and S.L. Cameron. 2013. Multigene phylogenetic analysis of south-east Asian pest members of the Bactrocera dorsalis species complek (Diptera:Tephritidae) does not support current taxonomy. Journal of Applied Entomology doi:10.111/jen.12047

Brinkman, F. S. L. And D. D. Leipe. 2001. Phylogenetic Analisis In Bioinformatics. A Practical Guides to the Analisys of Gene and Protein. John Willey and Sons. 323-358

Clarke, A. R., K. F. Armstrong., A. E.Carmichael, J. R. Milne., S. Raghu, G. K. Roderick,and D. K. Yeates. 2005. Invasive phytophagous pest arising trough a recent tropical evolutionary raditation: The Bactrocera dorsalis complex of fruit flies. Quteprint. http://eprints.qut.edu.au.

Delomen, M. C. L., M. S. Mendioro, and M. G. Q. Diaz. 2013. Morphometric analysis and fruit flies Bactrocera occipitalis (Bezzi) and B. philipinensis Drew and Hancock (Diptera: Tephritidae) from Cavite and Davao del Norte. Philippine Journal of Science. 142 (1): 69-76.

Dharmayanti, I. 2011. Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa. 21(1). 1-10.

Drew, R.A.I., and M. Romig. 2010. Fruit Flies. Biology, biosecurity, pest management and taxonomy. International Centre for the Management of Pest Fruit Flies. Griffith University. Brisbane.

Frey, J. E., L. Gullen, B. Frey, J. Samietz, J. Rull, and M. Aluja. 2013. Developing diagnostic SNP panels for theidentification of true fruit flies (Diptera: Tephritidae) within the limitsof COI-based specie delimitation.

BMC Evelutionary Biology 2013,    13:106. http://www.

Biomedcentral.com/1471-2148/13/106.

Holil, K. 2004. Buku Petunjuk Praktikum Teknis Analisis Biologi Molekuler. Jurusan Biologi. Fakultas Sains dan Teknologi. Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.

Jiang, F., Q.Jin, L. Liang, A.B. Zhang and Z. H. Li. 2014. Existences of species complex largely reduced barcoding success for invasive species of Tephritidae: a case study in Bactrocera spp. Molecular Ecology Resources (2014). doi:10.1111/1755-0998.12259.

Plant Health Australia. 2011.. The australian Handbook for The Identification of Fruit Flies Version 1.0. Australian Goverment. Department of Agriculture, Fisheries and Forestry. Canbera.

Pramudi, M. I., R. D. Puspitarini, dan B. T. Rahardjo. 2013. Keanekaragaman dan kekerabatan lalat buah (Diptera:Tephritidae) di Kalimantan Selatan berdasarkan karakter morfologi dan molekuler (RAPD PCR dan Sekuensing DNA). J HPT Tropikal. 13 (2) : 191 – 202.

Pujiastuti, Y., L. Kartini, C. Irsan,S. Herlinda, T. Adam, dan R. Thalib. 2009. Variasi jenis tanaman buah sebagai inang lalat buah (Diptera:Tephritidae) Pada berbagai ketinggian tempat di Sumatra Selatan. Jurnal Agripet Fakultas Pertanian Palangka Raya Kalimantan Tengah. 10 (2) : 58-64.

Siwi S. S., Purnama H. & Suputa. 2006. Taksonomi dan Bioekologi Lalat Buah Penting di Indonesia. BB-Biogen. Bogor.

Stephens, A.E.A., Kriticos D. J, and Leriche A. 2007. The Current and Future Potential Geographical Distribution of the Oriental Fruit Fly, Bactrocera dorsalis (Diptera:Tephritidae). Bulletin of Entomological Research97:309-378.

Tamura, K., Glen Stecher,Daniel Peterson, Alan Filipski, and Sudhir Kumar. 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30(12):2725–2729.

Wan, X., F. Nardi, B. Zhang, and Y. Liu. 2011. The oriental fruit fly, Bactrocera Dorsalis, In China: Origin and gradual inland range expansion associated with population growth. Plose One 6(10)    e25238

doi:10.1371/journal.pone.0025238.

Yu, D. J., Z. L. Chen, R. J. Zhang, and W. Y. Yin. 2005. Real time qualitative PCR for the Inspection And identification Of Bactrocera philipinensis And Bactrocera occipitalis (Diptera:Tephritidae) using Sybr Green Assay. The Raffles Buletin of Zoology 2005 53(1): 73-78.

Yu, D. J., L. Xu, F. Nardi, J. G. Li, R. J. Zhang. 2007. The Complete nucleotide sequence of the mitochondrial genome of the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Diptera:Thepritidae). Gene Vol. 396   (1)   :   66-74.

doi:10.1016/j.gene.2007.02.023

https://ojs.unud.ac.id/index.php/JASB

26