JURNAL SIMBIOSIS II (1): 135- 146

ISSN: 2337-7224

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana

Maret 2014


EKSTRAKSI DNA DARI HERBARIUM ANGGREK

(DNA EXTRACTION FROM ORCHID HERBARIUM MATERIALS)

UUL SHOVI NURKAMILA, MADE PHARMAWATI*

Jurusan Biologi F.MIPA Universitas Udayana, Kampus Bukit Jimbaran – Bali

*Email: pharmawati@hotmail.com

INTISARI

Ekstraksi DNA merupakan langkah awal dalam penelitian analisis biodiversitas maupun sistematika tumbuhan dengan penanda molekuler. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan ekstraksi DNA dari bahan herbarium dengan metode ekstraksi berbeda. Sebanyak 0,05 gram serbuk herbarium daun anggrek tanah Calanthe emarginata (Blume) Lindl. dan Goodyera procera (Ker-Gawl) Hook.digunakan untuk ekstraksi DNA dengan tiga metode berbeda. Metode tersebut adalah metode Doyle and Doyle dengan modifikasi waktu inkubasi selama 1,5 jam pada suhu 65o C dan peningkatan konsentrasi EDTA (50 mM), metode Dellaporta et al. dengan modifikasi waktu inkubasi (1,5 jam) pada suhu 65oC dan peningkatan konsentrasi EDTA (100 mM)serta metode Rogers and Bendich dengan modifikasi waktu inkubasi (1,5 jam) pada suhu 65oC dan pemberian 2x volume etanol. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa metode Doyle and Doyle dengan modifikasi menghasilkan DNA dari herbarium C. emarginata. Metode Rogers and Bendich dengan modifikasi juga menghasilkan DNA C. emarginata tetapi tidak konsisten. Metode Dellaporta et al. dengan modifikasimenghasilkan DNA dari herbarium G. procera. Metode Doyle and Doyle menghasilkan DNA G. procera tetapi tidak konsisten. PCR-RAPD yang dilakukan menunjukkan bahwa kualitas DNA dengan metode Doyle and Doyle dengan modifikasi tidak optimal karena menghasilkanpita DNA dengan pola yang tidak jelas. Metode Rogers and Bendich menghasilkan pita DNA yang lebih jelas pada PCR-RAPD tetapi hanya pada pita dengan ukuran yang kecil.

Kata kunci: anggrek, ekstraksi DNA, herbarium, PCR

ABSTRACT

DNA extraction is the first step to study plant systematic and biodiversity analysis using molecular markers. This study aimed to conduct DNA extraction from herbarium materials using different extraction methods. A total of 0.05 grams of herbarium powders of Calantheemarginata (Blume) Lindl. and Goodyera procera(Ker-Gawl) Hook. (terrestrial orchid) were used for samples by three different methods. The first method was from Doyle and Doyle with modification of incubation time for 1,5 hours at 65oC and increasing EDTA concentration to 50 mM. Second method was Dellaporta et al. with modification of incubation time for 1,5 hours (at 65oC) and increasing EDTA concentration to 100 mM. Third method was Rogers and Bendich with modification of incubation time for 1,5 hours (65oC) and adding ethanol twice. The results of electrophoresis revealed that method of Doyle and Doyle obtained DNA from C. emarginata herbarium, while method from Rogers and Bendich, unfortunately it was inconsistent. The method from Dellaporta et al.obtained DNA from G. procera herbarium, while method from Doyle and Doyle revealed inconsistent DNA forG. procera. PCR-RAPD revealed the quality of DNA isolated using Doyle and Doyle method was not optimal, showed by unclear patterns of DNA bands. PCR-RAPD using DNA isolated with method from Rogers and Bendich revealed clearer DNA bands but only for small size fragment.

Keywords : orchid, DNA extraction, herbarium, PCR

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana

Maret 2014


PENDAHULUAN

Perkembangan biologi molekuler yang pesat sejak akhir abad ke-20 ikut mendukung berkembangnyapenelitian-penelitian di bidang biologitermasuk biodiversitas dan sistematika tumbuhan. Penggunaan penanda molekuler, misalnya DNA dalam berbagai penelitian biodiversitas dan sistematika tumbuhan telah dilakukan secara intensif untuk mendukung data morfologi yang telah ada.Penggunaan penanda molekuler memiliki beberapa keuntungan, yaitu hasil yang konsisten dan dapat dideteksi pada semua jenis jaringan dengan berbagai tahap perkembangan, serta tidak dipengaruhi oleh kondisi lingkungan (Mondini et al., 2009). Penelitian biodiversitas dan sistematika tumbuhan yang menggunakan analisis dengan penanda molekuler diawali dari ekstraksi DNA (Pharmawati, 2009). Sampel untuk ekstraksi DNA tumbuhan dapat berasal dari berbagai sumber, seperti jaringan segar, jaringan yang dibekukan dengan nitrogen cair (Sozen and Poyraz, 2008), jaringan yang dikeringkan dengan silika gel (Cota-Sanchez et al., 2006)dan jaringan herbarium (Lambertini et al., 2008).

Herbarium yang telah dikoleksi berpotensi untuk digunakan sebagai sumber sampel DNA dari spesies langka ataupun

spesies dari daerah terpencil (Mazo et al., 2012).Anggrek merupakan tumbuhan yang sering menjadi objek eksplorasi oleh peneliti untuk tujuan pendataan kekayaan hayati dan konservasi ex situ. Di Bukit Silangjana, Lemukih, Kabupaten Buleleng ditemukan beberapa spesies anggrek, dua diantaranya adalah Calantheemarginata (Blume) Lindl. dan Goodyera procera (Ker-Gawl) Hook. yang merupakan anggrek tanah (Tirta, 2011). Kedua spesies anggrek ini menjadi koleksi Herbarium Biologi Unud (HBU) dan dipilih menjadi model pada penelitian ini.

Saat ini terdapat beberapa metode ekstraksi DNA tumbuhan menggunakan bahan herbarium, tetapi tiap spesies memiliki kesulitan tersendiri, tergantung proses pengeringan dan waktu penyimpanan (usia herbarium) dalam fasilitas penyimpanan (Mazo et al., 2012). Kondisi sebelum dikeringkan dan tahap pertumbuhan ketika dikeringkan juga sangat mempengaruhi kualitas DNA yang dihasilkan. Kualitas DNA hasil ekstraksi mempengaruhi analisis lebih lanjut seperti hibridisasi DNA, pemotongan DNA dengan enzim restriksi maupun analisis dengan polymerase chain reaction (PCR) (Pharmawati, 2009). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode ekstraksi DNA

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana

Maret 2014


yang dapat menghasilkan DNA dari bahan herbarium dengan kualitas yang baik.

MATERI DAN METODE

Sampel herbarium (Tabel 1) digerus dalam mortar dan pestle hingga menjadi serbuk, kemudian disaring dengan alat

penyaring sehingga didapat serbuk herbarium yang sangat halus. Serbuk tersebut ditimbang sebanyak 0,05 g dengan dua kali pengulangan pada tiap metode ekstraksi DNA. Herbarium tersebut merupakan koleksi dari Herbarium Biologi UNUD yang dibuat tahun 2011.

Tabel 1. Informasi sampel herbarium yang digunakan

Spesies

Deskripsi

Lokasi

Kolektor

Tahun

C. emarginata

Tinggi tanaman 20-30 cm, panjang daun 27 cm, lebar 12 cm, panjang dorsal sepal 2 cm, apex labellum pinggirannya berlekuk, berbau harum.

Bukit Silangjana, Lemukih, Buleleng

Ni Made Gari

2011

G. procera

Tinggi tanaman 20-40 cm, bunga berwarna putih, kulit kayu halus, tidak memiliki pola pada daun

Bukit Silangjana, Lemukih,Bulelen g

Ni Made Gari

2011


Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana 2014

Ekstraksi DNA Metode Doyle and Doyle (1990) dengan Modifikasi

Sebanyak 0,05 g sampel ditambahkan 1,2 ml buffer ekstraksi (3% CTAB, 100 mM Tris/HCl pH 8, 1.4 M NaCl, 50 mM EDTA pH 8, 2% mercaptoethanol) yang sudah dipanaskan pada suhu 65oC. Tabung diinkubasi pada suhu 65oC selama 1,5 jam dalam penangas air dan dibolak-balik secara kontinyu setiap 5 menit. Tabung disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 10 menit, supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan kloroform isoamilalkohol 24:1. Campuran dihomogenkan dan disentrifugasi selama 10 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan isopropanol dingin kemudian diinkubasi pada suhu -20oC selama 16 jam. Tabung disentrifugasi, pelet dicuci dengan etanol 70% dan disentrifugasi selama 3 menit. Pelet dikeringanginkan dan ditambahkan 100 µl air steril.

Ekstraksi DNA Metode Dellaporta et al. (1983) dengan Modifikasi

Sebanyak 0,05 g sampel ditambahkan 1,2 ml buffer ekstraksi (10% SDS, 50 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 100 mM EDTA pH 8, 20 µl/ml β-mercaptoethanol) yang sudah dipanaskan pada suhu 65oC. Tabung diinkubasi pada suhu 65oC selama 1,5 jam dalam penangas air dan dibolak-balik

Maret

secara kontinyu setiap 5 menit. Ditambahkan 300 µl 5 M Na asetat. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 16 jam. Tabung disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 10 menit, supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan kloroform isoamilalkohol 24:1. Setelah sentrifugasi selama 10 menit, lapisan atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan isopropanol dingin, kemudian diinkubasi pada suhu -20oC selama 16 jam. Tabung disentrifugasi, pelet dicuci dengan etanol 70% dan disentrifugasi kembali selama 3 menit. Pelet dikeringanginkan dan ditambahkan 100 µl air steril.

Ekstraksi DNA Metode Rogers and Bendich (1985) dengan Modifikasi

Sebanyak 0,05 g sampel ditambahkan 1,2 ml buffer ekstraksi (3% CTAB, 100 mM Tris/HCL pH 8, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA pH 8, 2% mercaptoethanol) yang sudah dipanaskan pada suhu 65oC. Tabung diinkubasi pada suhu 65oC selama 1,5 jam dalam penangas air dan dibolak-balik secara kontinyu setiap 5 menit. Tabung disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan kloroform isoamilalkohol 24:1. Campuran dihomogenkan dan disentrifugasi selama 2 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana 2014

baru dan ditambahkan buffer 10% CTAB (10% CTAB, 0.7 M NaCl) yang telah dipanaskan pada suhu 65oC, kemudian ditambahkan kloroform isoamilalkohol 24:1 dan disentrifugasi selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan buffer 1% CTAB (1% CTAB, 50 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA pH 8) dan disentrifugasi selama 3 menit. Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE(10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 1 M NaCl), ditambahkan 2x volume etanol, kemudian diinkubasi pada suhu -20oC selama 16 jam. Tabung disentrifugasi selama 3 menit dan pelet dicuci dengan etanol 70%, kemudian dikeringanginkan dan ditambahkan 100 µl air steril.

Elektroforesis DNA

Sebanyak 10 µl larutan DNA dilektroforesis menggunakan 1% gel agarosa dalam buffer 1x TAE (Tris acetate-EDTA). Lambda DNA (400 ng) digunakan sebagai pembanding untuk menentukan konsentrasi DNA yang dihasilkan. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 100 volt selama 40 menit, kemudian direndam dalam larutan etidium bromida selama 30 menit dan

HASIL

Hasil ekstraksi DNA menghasilkan pelet yang sebagian besar berwarna coklat.

Maret

diamati pada UV transluminator. Konsentrasi DNA ditentukan dengan membandingkan tingkat pendaran pita DNA hasil ekstraksi dengan lambda DNA.

PCR-RAPD

PCR-RAPD dilakukan berdasarkan Chandra (2011). Volume reaksi PCR adalah 20µl dan mengandung 1 x buffer Taq polymerase (MD Bio), 200µM dNTP, 2 mM MgCl2, 1 U Taq polymerase, 2mM primer dan 10ng DNA. PCR dilakukan dalam termocycler (MyGenie) dengan siklus 5 menit denaturasi awal pada suhu 95oC, diikuti 35 kali 1 menit denaturasi pada suhu 95oC, 1,5 menit annealing pada 36oC, 1,5 menit pemanjangan pada 72oC dan setelah 35 siklus ditambah 1 siklus pemanjangan akhir selama 10 menit pada 72oC. Primer yang digunakan adalah OPD14 (CTTCCCCAAG) dan OPF11 (TTG GTA CCC C).

Sebanyak 10 µl produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1,8% selama 40 menit pada tegangan 100 Volt. Selanjutnya gel diwarnai dengan etidium bromida dan diamati dengan UV transiluminator.

Ringkasan hasil ekstraksi DNA ditampilkan pada Tabel 2.

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana

Maret 2014


Tabel 2. Konsentrasi dan warna pelet DNA yang dihasilkan

Sampel

Konsentrasi (ng/µl)

Warna Pelet

Doyle

Dellaporta

Rogers

Doyle

Dellaporta

Rogers

C. emarginata

2.5

0

0

Coklat

Putih

Putih

5

0

6

G. procera

0

2

0

Coklat

Coklat

Putih

2

2

0

Keterangan: Doyle = Metode Doyle and Doyle (1990) Dellaporta = Metode Dellaporta et al. (1983) Rogers = Metode Rogers and Bendich (1985)

Sampel DNA C. emarginata yang diekstrak berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990) serta Rogers and Bendich dengan jelas setelah dielektroforesis, sedangkan metode Dellaporta et al. (1983) tidak menunjukkan adanya pita DNA. Sampel DNA G. procera yang diekstrak berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990) serta metode Dellaporta et al. (1983) dengan modifikasi menunjukkan adanya pita DNA yang samar, sedangkan metode Rogers

(1985) dengan modifikasi menunjukkan adanya pita DNA (tanda panah pada Gambar 1)

and Bendich (1985) tidak menunjukkan adanya pita DNA.

Hasil PCR-RAPD dengan primer OPD 14 dan OPF 11 menggunakan DNA hasil ekstraksi dengan metode Doyle and Doyle (1990), Dellaporta et al. (1983) serta metode Rogers and Bendich (1985) menunjukkan pola fragmen yang tidak jelas (Gambar 2 a dan b).

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana

Maret 2014


C. emarginata


G. procera


1 2 3   4   5 6 λ 1 2   3   4   5 6λ

SmearDNA <

RNA


Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA C. emarginata dan G. procerayang diekstrak berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990) (1 dan 2), Dellaporta et al. (1983) (3 dan 4) serta Rogers and Bendich (1985) (5 dan 6). Lambda DNA (λ) 400 ng digunakan sebagai pembanding. Tanda panah menunjukkan DNA dengan ukuran besar

C. emarginata

G. procera


C. emarginata


G. procera


1 2 56 1 2 100bp

a


1 2 5 6 1 2

3  4 100bp

b

500

200


Gambar 2. Hasil PCR-RAPD dengan primer OPD14 (a) dan OPF11 (b). DNA template diekstrak dengan metode Doyle and Doyle (1 dan 2), Dellaporta et al. (3 dan 4) dan Rogers and Bendich (5 dan 6)

PEMBAHASAN

Metode ekstraksi DNA tidak semuanya cocok untuk semua jenis tumbuhan, sehingga dilakukan modifikasi agar diperoleh DNA dengan kualitas yang baik untuk analisis selanjutnya (Padmalatha and Prasad, 2006). Modifikasi pada ketiga metode ekstraksi DNA adalah inkubasi pada suhu 65oC selama 1,5 jam untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstraksi yang ditambahkan ke dalam sampel (Syafaruddin dan Santoso, 2011). Modifikasi yang lain berupa peningkatan konsentrasi EDTA menjadi 50 mM pada metode Doyle and Doyle (1990) dan peningkatan konsentrasi EDTA menjadi 100 mM pada Metode Dellaporta et al. (1983) untuk mengikat ion magnesium yang merupakan kofaktor enzim DNAse (Pharmawati, 2009; Zidani et al., 2005). Modifikasi pada metode Rogers and Bendich (1985) adalah pemberian 2x volume etanol untuk mempresipitasi DNA (Telfer et al., 2013) dan menghilangkan residu garam dari larutan sebelumnya (Mazo et al., 2012).

Metode Doyle and Doyle (1990) serta Rogers and Bendich (1985) menggunakan buffer ekstraksi yang mengandung deterjen CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide), deterjen ini mampu menghilangkan kompleks polisakarida serta

Maret 2014 lipid dari membran dan dinding sel kemudian mempresipitasi DNA (Moore et al., 2004), tetapi memiliki kelemahan mudah mengendap pada suhu 15oC(Surzycki, 2000). Metode Dellaporta et al.(1983) menggunakan buffer ekstraksi yang mengandung deterjen SDS (sodium dodecyl sulfate),deterjen ini mampu mendenaturasi protein dari membran dan dinding sel (Moore et al., 2004) serta mengurangi aktivitas enzim DNAse (Chaput and Switzer, 1999), tetapi tidak mampu menghilangkan polisakarida (Moore et al., 2004).

Ekstraksi DNA C. emarginata berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990) dengan modifikasi menunjukkan pita DNA yang konsisten, sedangkan metode Rogers and Bendich (1985) dengan modifikasi menunjukkan pita DNA yang tidak konsisten karena hanya terdapat pada satu dari dua ulangan. Hasil yang tidak konsisten dapat terjadi karena pemipetan supernatan yang tidak maksimal sehingga DNA banyak yang terbuang atau sampel DNA tidak benar-benar masuk ke sumur gel agarosa ketika elektroforesis (Restu dkk, 2012).Metode Dellaporta et al. (1983) dengan modifikasi tidak menunjukkan adanya pita DNA, kemungkinan karena sampel sangat terkontaminasi polisakarida

JURNAL SIMBIOSIS II (1): 135- 146

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana yang ditunjukkan dengan tertinggalnya DNApada sumur gel pada saat elektroforesis (Pharmawati, 2009).

Ekstraksi DNA G. procera berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990) dengan modifikasi dan metode Dellaporta et al. (1983) dengan modifikasi menunjukkan pita DNA yang samar. Hal tersebut menandakan konsentrasi DNA yang diperoleh sangat sedikit (Mazo et al., 2012). Metode Rogers and Bendich (1985) dengan modifikasi tidak menunjukkan pita DNA, kemungkinan karena konsentrasi DNA yang dihasilkan sangat sedikit sehingga tidak terlihat ketika divisualisasikan pada gel agarosa (Staats et al., 2011). Proses pengeringan menyebabkan sel pecah dengan cepat, bersamaan melepaskan nuklease, ROS (Reactive Oxygen Species) dan enzim seluler lainnya yang menyebabkan konsentrasi DNA yang dihasilkan sangat sedikit, sehingga tidak terlihat ketika divisualisasikan pada gel agarosa (Staats et al., 2011). Smear pada pita DNA menandakan DNA telah terfragmentasi. Panjang dan kualitas fragmen DNAberhubungan dengan tingkat degradasi DNA, semakin lama spesimen disimpan, maka semakin besar fragmentasi DNA yang terjadi (Andreasen and Manktelow, 2009). Setiap spesies mengalami proses degradasi dan kerusakan

ISSN: 2337-7224 Maret 2014 yang berbeda ketika proses pengeringan dan kandungan senyawa kimia tertentu yang mereka miliki dapat mendukung atau bahkan mengganggu proses ekstraksi DNA (Yang et al., 1997),sehingga pada sampel yang berasal dari spesies yang sama dapat diperoleh konsentrasi DNA yang berbeda (Tabel 1) (Mazo et al., 2012).

DNA yang diperoleh memiliki kualitas yang tidak baik yang ditunjukkan dengan tidak jelasnya pola fragmen DNA produk PCR-RAPD. PCR memerlukan DNA dengan kualitas yang baik yang tidak mengandung senyawa fenolik maupun kontaminan lain seperti polisakarida (Pharmawati, 2009; Restu dkk, 2012). Pada penelitian ini DNA hasil ekstraksi telah terderadasi yang ditunjukkan dengan munculnya smear. DNA yang terdegradasi menandakan kerusakan nukleotida yang mengakibatkan primer tidak dapat menempal pada DNA template (Pharmawati, 2009; Nuraini dkk, 2012) dan dapat mengakibatkan menurunnya kemampuan enzim polimerase mengakses DNA pada proses amplifikasi (Staats et al., 2011). Modifikasi lain harus dilakukan untuk mendapatkan DNA dengan kualitas baik dari material herbarium tanaman.

SIMPULAN

Metode Doyle and Doyle dengan modifikasi menghasilkan DNA dari herbarium C. emarginata. Metode Rogers and Bendich (1985) dengan modifikasi juga menghasilkan DNA C. emarginata tetapi tidak konsisten. Metode Dellaporta et al.(1983)dengan modifikasimenghasilkan DNA dari herbarium G. procera. Metode Doyle and Doyle (1990) menghasilkan DNA G. procera tetapi tidak konsisten. PCR-RAPD menunjukkan bahwa kualitas DNA dengan metode Doyle and Doyle (1990) dengan modifikasi tidak optimal dan menghasilkan pita DNA dengan pola yang tidak jelas, sedangkan metode Rogers and Bendich (1985) menghasilkan pita DNA yang lebih jelas pada PCR-RAPD tetapi hanya pada pita dengan ukuran yang kecil.

KEPUSTAKAAN

Andreasen, K. and M. Manktelow. 2009. Succesful DNA Amplification of a More than 200 Year Old Herbarium Specimen:    Recovering Genetic

Material from the Linnaean Era. Taxon. 58(3): 959-962.

Chandra, I.P. 2011. Keragaman Genetik Nilam (Pogostemon cablin Benth) yang Dibudidayakan di Bali Berdasarkan Marka Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana, Universitas Udayana. (Tesis). Tidak Dipublikasikan.

Maret 2014

Chaput, J.C. and C. Switzer. 1999.A DNA Pentaplex Incorporating Nucleobase Quintets. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 96(16): 10614-10619.

Cota-Sanchez, J.H., K. Remarchuk, K. Ubayasena. 2006. Ready-to-Use DNA Extracted with a CTAB Method Adapted for Herbarium Specimens and Mucilaginous Plant Tissue. Pl. Mol. Biol. Rep. 24: 161-167.

Dellaporta S. L., J. Wood and J.B. Hick. 1983. A Plant Minipreparation: version II. Pl. Mol. Biol. Rep.1: 19-20.

Doyle J.J. and J.L. Doyle. 1990. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue. Focus 12: 13-15.

Lambertini, C., J. Frydenberg, M.H.G. Gustafsson, H. Brix. 2008. Herbarium Specimens as a Source of DNA for AFLP Fingerprinting of Phragmites (Poaceae):      Possibilities and

Limitations. Pl. Syst. Evol. 272: 223– 231.

Mazo, L.C., G. Alberto, R.Q. Sonia, E.B. Jaime, O.V. Pedro. 2012. Extraction and Amplification of DNA from Orchid Exsiccates Conserv for More than Half a Century in a Herbarium in Bogota, Colombia. Lankesteriana. 12(2): 121-129.

Mondini, L., A. Noorani, M.A. Pagnotta. 2009. Assesing Plant Genetic Diversity by Molecular Tools. Diversity. 2009(1): 19-35.

Moore, E., A. Arnscheidt, A. Kruger, C. Strompl, M. Mau. 2004. Simplified Protocol for Preparation of Genomic DNA from Bacterial Cultures. Mol.

Microb. Eco. Man. Sec. Edition. 1(1): 3-18.

Nuraini, I., S.E. Kusuma, A. Sosiawan. 2012. Analisis Pengaruh Waktu dan Pencucian Deterjen terhadap DNA Bercak Cairan Semen pada Lokus FGA dengan Metode STR-PCR. JBP. 14(2): 106-114.

Padmalatha, K., and M.N.V. Prasad. 2006. Optimization of DNA Isolation and PCR Protocol for RAPD Analysis of Selected Medicinal and Aromatic Plants of Conservation Concern from Peninsular India. African J. Biotech. 5(3): 230-234.

Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi Ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada Grevillea spp. (Proteaceae). J. Biologi. 8(1): 1216.

Restu, M., Mukrimin., Gusmiaty. 2012. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman Genetik Berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). J. Nature Ind. 14(2): 138142.

Rogers, S.O., and A.J. Bendich. 1985. Extraction of DNA from Miligram Amounts of Fresh, Herbarium, and Mummifield Plant Tissues. Pl. Mol. Biol. 5: 69-76.

Sozen, E. and I. Poyraz. 2008. Rapid and High Quality DNA Isolation from Origanum onites for RAPD and ISSR Analysis. Z. Naturforsch. 63c: 595598.

Maret 2014

Seberg, F.T. Bakker. 2011. DNA Damage in Plant Herbarium Tissue. PloS ONE. 6(12): e28448.

Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. SpringerVerlagPublisher. Berlin.

Syafaruddin dan T.J. Santoso. 2011. Optimasi Metode Isolasi dan Purifikasi DNA yang Efisien dan Efektif pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). J. Littri. 17(1): 11-17.

Telfer, E., N. Graham, L. Stanbra, T. Manley, P. Wilcox. 2013. Extraction of High Purity Genomic DNA from Pine for Use in a High-Throughput Genotyping Platform. New Zeal. J. For. Sci. 43(3): 1-8.

Tirta, I.G. 2011. Ekplorasi flora di bukit Silangjana, Singaraja, Bali. Widyatech, J. Sain. Tek. 11(2):105-111.

Yang, H., E. Golenberg, J. Shishani. 1997. Proboscidean DNA from Museum and Fossil Specimens: an Assessment of Ancient DNA Extraction and Amplification Techniques. Biochem. Genet. 35(5): 165-178.

Zidani, S., A. Ferchichi, M. Chaib. 2005. Genomic DNA Extraction Method from Pearl Millet   (Pennisetum

glaucum) Leaves. African J. Biotech. 4(8): 862-866.

Staats, M., A. Cuenca, J.E. Richardson, R.

Vrielink-van Ginkel, G. Petersen, O.