Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Limbah Kulit Buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus) pada Sel Kanker Payudara Secara In Vitro dan In Silico
on
Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Limbah Kulit Buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus)
pada Sel Kanker Payudara Secara In Vitro dan In Silico
(Sarasmita, M.A, Laksmiani, N.P.L.)
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL LIMBAH KULIT BUAH NAGA MERAH (Hylocereus polyrhizus) PADA SEL KANKER PAYUDARA SECARA IN INVITRO DAN IN SILICO
Sarasmita, M.A1, Laksmiani, N.P.L2
-
1,2Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana
Korespondensi: Made Ary Sarasmita
Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana Jalam Kampus Unud-Jimbaran, Jimbaran-Bali, Indonesia 80364 Telp/Fax: 703837 Email: [email protected]
ABSTRAK
Kanker payudara merupakan salah satu penyakit yang menimbulkan angka kesakitan dan kematian tertinggi. Penderita kanker payudara pada stadium lanjut menggunakan sitostatika yang meningkatkan resiko adverse drug reaction. Buah naga (Hylocereus polyrhizus) mengandung senyawa yang diduga berperan sebagai antioksidan. Kandungan flavonoid dalam kulit buah naga diduga memiliki aktivitas antioksidan yang mampu menurunkan ROS sehingga dapat mencegah kanker. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis aktivitas sitotoksik ekstrak etanol kulit buah naga pada sel kanker payudara MCF-7 secara in vitro dan mengkaji mekanisme molekuler dari komponen aktif ekstrak ethanol kulit buah naga secara in silico dengan protein target PgP, IKK dan HER-2. Uji sitotoksisitas ekstrak ethanol kulit buah naga merah dilakukan dengan metode MTT. IC50 ekstrak kulit buah naga merah diukur terhadap sel MCF-7. Uji docking molekular (in silico) dilakukan dengan preparasi protein, preparasi senyawa uji, validase metode molecular docking dan docking betasianin pada HER-2, Pgp dan IKK. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak kulit buah naga memiliki potensi sebagai agen sitotoksik pada sel MCF-7 dengan nilai IC50 387,49 μg/mL. Potensi sitotoksik dari kulit buah naga merah diperantarai oleh kemampuan betasianin menghambat protein target IκB kinase (IKK) dengan afinitas -6,15 kkal/mol, sehingga NF-κB terinaktivasi dan proliferasi sel MCF-7 dapat terhambat.
Kata kunci : Hylocereus polyrhizus, sitotoksik, carcinoma mammae, betasianin, docking
|
1. Pendahuluan |
doxorubicin. Penggunaan doxorubicin |
|
Kanker payudara merupakan salah |
dapat menyebabkan resistensi karena |
|
satu kanker terbanyak pada wanita |
dapat menginduksi over-ekspresi P- |
|
yang menimbulkan angka kesakitan |
glycoprotein (Pgp) yang menyebabkan |
|
dan kematian yang tinggi (Ruddon, |
efflux (pengeluaran) obat kemoterapi |
|
2007). Salah satu target penting pada |
dari dalam sel. Pgp merupakan |
|
terapi kanker payudara adalah |
downstream dari NFκB, suatu faktor |
|
Estrogen Receptor (ER) seperti HER-2 |
transkripsi yang penting dalam |
|
yang mempunyai peranan dalam |
proliferasi sel. Aktivitas NFκB |
|
proliferasi dan perkembangan kanker |
diregulasi oleh IκB Kinase (IKK) |
|
payudara. Salah satu contoh agen |
(Deng et al., 2001). Oleh karena itu |
|
kemoterapi yang digunakan adalah |
HER-2, Pgp dan IKK menjadi target yang penting dalam pengembangan agen bertarget molekular. Penggunaan agen kemoterapi berpotensi menimbulkan efek samping pada sel normal dan menekan sistem imun. Suatu pengembangan obat yang selektif terhadap sel kanker payudara namun tidak menimbulkan kerusakan pada sel normal diperlukan.
Salah satu upaya kemoprevensi adalah mengembangkan agen antikanker dari tumbuhan obat tradisional yang merupakan bagian dari keanekaragaman hayati Indonesia. Buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) adalah tumbuhan buah yang mudah dijumpai dan sering hanya dimanfaatkan daging buahnya untuk konsumsi. Pemanfaatan limbah kulit buah naga belum banyak diteliti dan dikembangkan sebagai obat. Salah satu senyawa kimia yang memiliki efek antikanker adalah senyawa flavonoid. Flavonoid memiliki aktivitas menangkap radikal bebas (Reactive Oxygen Species / ROS) yang dapat menekan proses proliferasi sel kanker. Kulit buah naga diketahui memiliki kandungan flavonoid seperti betasianin.
Tujuan penelitian ini untuk mengembangkan limbah kulit buah naga merah sebagai agen antikanker pada sel kanker payudara melalui aktivitas sitotoksik pada sel kanker payudara yang dimodelkan oleh sel MCF-7 secara in vitro dengan menganalisis nilai IC50 dari ekstrak etanol kulit buah naga merah. Selain itu menganalisis mekanisme molekuler yang memperantarai efek sitotoksiknya terhadap sel kanker payudara melalui docking molekuler atau in silico.
Alat perlindungan diri, waterbathsuhu 37°C, Laminar Air
Flow Hood (LAF), inkubator CO2, tissue cultureflask/dish, pen marker, mikropipet, tip, rak ampul/tempat eppendorf, alat-alat gelas, flakon, timbangan analitik, mikroskop cahaya, inverted microscope, tabung konikal, haemocytometer, cell counter, kamera digital, autoklaf, filter, vorteks, sentrifuse. Alat ujiin silico meliputi seperangkat komputer dengan spesifikasi Windows 7 32 bit dan program co-PenDrive Linux untuk simulasi Linux pada Windows, Autodock 4.2 untuk molekular docking, Autodock 4.2 untuk preparasi protein, dan Marvin Sketch untuk preparasi senyawa uji betasianin.
Kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus), etanol 96%, Sel kanker payudar jenis MCF-7. Kultur sel ditumbuhkan dalam media penumbuh Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) high glucose yang mengandung Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisillin-streptomisin 1 % (v/v) (Gibco), tripsin.
Bubuk simplisia kulit buah naga merah yang sudah dikeringkan dalam oven suhu 500C selama 24 jam sebanyak 1 kg dimaserasi dengan pelarut etanol asam dengan perbandingan 1:5 (bahan: pelarut). Maserasi dilakukan selama 24 jam dengan dan diremaserasi sebanyak 2 kali. Maserat kemudian disaring dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator.
Sel dengan kepadatan 1 x 104 sel/sumuran didistribusikan ke dalam plate 96 sumuran dan
diinkubasi selama 24 jam. Media diambil, dicuci PBS, ditambahkan 100 µl media kontrol atau sampel, inkubasi selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 µl PBS. Kemudian ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 µl media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, dicuci PBS kemudian ditambahkan larutan asam isopropanol 200 µl untuk melarutkan kristal formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.
Uji docking dimulai dengan preparasi protein HER-2, IKK, dan PgP yang berikatan dengan native ligand. Optimasi struktur senyawa uji dilakukan dengan program Marvin Sketch. Pada tahap validasi metode docking molekuler, native ligand di-docking-kan kembali pada protein yang telah dihilangkan native ligand-nya. Hasil analisis menunjukkan Root Mean Square Distances (RMSD) Heavy Atoms senyawa hasil docking dibandingkan dengan referensi. Docking senyawa uji betasianin pada protein yang sudah dihilangkan native ligand-nya menggunakan program Autodock 4.2.
-
3. Hasil Penelitian dan Pembahasan 3.1 Bobot dan pH esktrak etanol kulit buah naga
Bobot ekstrak kulit buah naga yang diperoleh sebesar 268,5448 gram dengan rentang pH ekstrak kulit buah naga yaitu 5,10 – 5,27.
Ekstrak etanol kulit buah naga merah mempunyai aktivitas sitotoksik pada sel MCF-7 dengan nilai IC50 387,49 μg/mL. Efek sitotoksik ekstrak etanol kulit buah naga merah terjadi mulai konsentrasi 200 μg/mL pada sel MCF-7 dimana mulai terlihat adanya sel yang mati yang terbentuk bulat mengambang dan rata-rata persentase viabilitas selnya ±standard error (SE) dari 3 kali eksperimen adalah 66,1 % ± 7,1.
Gambar 3.1. Efek perlakuan ekstrak etanolik kulit buah naga merah terhadap viabilitas sel MCF-7.
Gambar 3.2. Efek perlakuan ekstrak etanolik kulit buah naga merah terhadap morfologi sel MCF-7 setelah diinkubasi selama 24 jam.
Tabel di bawah ini menjelaskan tentang jumlah konsentrasi dan persentase viabilitas sel ekstrak etanol kulit buah naga.
Tabel 3.1Persentase viabilitas sel ±standard error (SE) ekstrak etanolik kulit buah naga merah
|
N o |
Konsen -trasi |
Persentase Viabilitas Sel |
Rata rata | ||
|
μg/mL |
I |
II |
III |
Viabilitas Sel ± SE | |
|
1 |
50 |
100.67 |
89.91 |
111.24 |
100.61 ± 6,16 |
|
2 |
100 |
93.92 |
105.41 |
82.26 |
93.86 ± 6,68 |
|
3 |
200 |
52.19 |
70.6 |
75.52 |
66.1 ± 7,1 |
|
4 |
400 |
26.85 |
35.97 |
29.04 |
30.62 ± 2,75 |
|
5 |
800 |
4.07 |
7.17 |
11.18 |
7.47 ± 2,06 |
(a) (b)
Gambar 3.3(a) Interaksi antara native ligand dengan protein target IKK; (b) Interaksi antara betasianin dengan protein target IKK.
Sel MCF-7 merupakan salah satu jenis sel adenokarsinoma payudara yang diperoleh dari pleural efusi wanita kaukasian berumur 69 tahun penderita kanker payudara golongan darah O, dengan Rh positiftahap metastasis. Sel MCF-7 tanpa perlakuan tidak menunjukkan adanya ekspresi Pgp, tetapi selMCF-7 dengan perlakuan doxorubicin terjadi over-ekspresi Pgp (Simsteinet al., 2003). Pgp merupakan suatu transporter yang termasuk dalam keluarga ATP-binding cassette (ABC). NF-κB merupakan faktor transkripsi yang aktif akan meningkatkan transkripsi gen MDR1 pengkode PgP maupun protein anti apoptosis Bcl-2 (Ruddon, 2007). Pgp mempertahankan konsentrasi agen kemoterapi yang rendah di dalam sel dengan memompa obat ke luar dari sel, sedangkan Bcl-2 meningkatkan penghambatan dalam pemacuan apoptosis. Sehingga adannya inaktivasi NF-κB oleh IκB kinase (IKK) akan menghambat ekspresi Pgp maupun Bcl-2(Deng et al., 2001).
Sitotoksik merupakan sifat toksik atau beracun suatu senyawa terhadap sel yang hidup. Uji sitotoksisitas secara in
vitromenggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas antineoplastik dari suatu senyawa (Ricci, 2006). Uji ini digunakan secara luas untuk menggantikan uji toksisitas secara in vivo yang menggunakan hewan. Beberapa alasan penggantian uji ini antara lain adalah uji sitotoksisitas in vitro lebih ekonomis daripada uji toksisitas menggunakan hewan, keterbatasan model hewan untuk dapat dikorelasikan hasilnya pada manusia karena adanya perbedaan antar spesies, dan adanya dorongan moral untuk mengurangi percobaan yang menggunakan hewan (Ricci, 2006).
Sampai saat ini, aktivitas antioksidan kulit buah naga merah diketahui masih terbatas pada pengujian tingkat ekstrak dan fraksi. Penelitian menyebutkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit buah naga (IC50 0,3 mg/ml) lebih tinggi daripada aktivitas antioksidan pada daging buahnya (IC50> 1 mg/ml) (Nurliyana, 2012).
Penelitian lain juga melakukan uji aktivitas ekstrak kulit buah naga dengan beberapa pelarut yang tingkat kepolarannya berbeda-beda. Ekstrak kulit buah naga merah dalam pelarut n-heksana diketahui memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 853,543 µg/ml (Putra, 2012). Ekstrak kulit buah naga merah dalam pelarut methanol memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 634,292 µg/ml (Romadhona, 2012). sedangkan pengujian ekstrak kulit buah naga dengan pelarut kloroform menunjukkan aktivitas antioksidan yang cukup besar yaitu nilai IC50 sebesar 43,836 µg/ml (Mitasari, 2012).
Sebelum dilakukan analisa docking molekuler dipastikan terlebih dahulu validitas dari metode yang digunakan dengan melihat nilai RMSD antara native ligan dengan protein target. Nilai RMSD yang dapat diterima dan metode dinyatakan valid bila RMSD 1-3 Å. Pgp
dengan ligan memiliki nilai RMSD 1,49, sedangkan IKK dengan ligan memiliki RMSD 0,74 dan HER-2 dengan ligannya, menghasilkan RMSD 2,62. Bila dilihat dari nilai RMSD maka interaksi molekuler dapat dilanjut ke tahap berikut.
Potensi sitotoksik dari kulit buah naga merah diperantarai oleh kemampuan betasianin menghambat protein target IκB kinase (IKK) sehingga NF-κB terinaktivasi dan proliferasi sel MCF-7 dapat terhambat. Namun afinitasnya masih lebih rendah dari native ligannya untuk protein target IKK yaitu -6,15 kkal/mol sedangkan native ligan dengan IKK sebesar -9,82 kkal/mol.
Sedangkan ikatan antara betasianin dengan Pgp afinitasnya lebih besar (+15,90 kkal/mol) dibandingkan dengan native ligan yaitu -8,88 kkal/mol dan HER-2 dengan betasianin memiliki nilai energi ikatan sebesar +14,19 kkal/mol. HER-2 dengan ligannya sendiri, nilai energi ikatannya -7,01 kkal/mol. Hal ini menunjukkan ekstrak etanol kulit buah naga merah memiliki potensi sitotoksik terhadap sel MCF-7 melalui penghambatan protein IKK sehingga proliferasi sel kanker payudara MCF-7 dapat dihambat.
Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah naga merah memiliki potensi sebagai agen sitotoksik pada sel kanker payudara melalui uji sitotoksisitas secara invitro dan insilico. Hal ini dapat disebabkan karena ekstrak kulit buah naga banyak mengandung senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas anti oksidan dan mencegah pembentukan radikal bebas. Penelitian Rebecca (2010) menguji identifikasi pigmen dan aktivitas antioksidan ekstrak buah naga merah (Hylocereus polyrhizus). Dari hasil penelitian menggunakan instrument HPLC disebutkan buah naga merah mengandung betanin. Selain itu, nilai total fenolik buah naga sebesar 86,10 mg dari total 0,5 gram ekstrak kering buah naga. Aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
penangkap radikal menunjukkan konsentrasi efektif buah naga sebesar 2,90 mM ekuivalen dengan vitamin C/gram ekstrak kering.
Penelitian Pranata (2013) menguji aktivitas antioksidan dari kulit buah naga merah dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dan uji aktivitas antioksidan dengan metode KLT (kromatografi lapis tipis). Penelitian Pranata (2013) menyebutkan hasil skrining fitokimia ekstrak kulit buah naga mengandung flavonoid dan triterpenoid dan memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 3349,936 µg/ml (Pranata, 2013).
Ekstrak kulit buah naga memiliki potensi sebagai agen sitotoksik pada sel MCF-7 dengan nilai IC50 387,49 μg/mL. Potensi sitotoksik dari kulit buah naga merah diperantarai oleh kemampuan betasianin menghambat protein target IκB kinase (IKK) dengan afinitas -6,15 kkal/mol sehingga NF-κB terinaktivasi dan proliferasi sel MCF-7 dapat terhambat.
Ucapan terima kasih diucapkan untuk Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM) Universitas Udayana, Fakultas MIPA Unud, Laboratorium Toksikologi Forensik, Lembaga Sains dan Forensik Unud, dan Cancer Chemoprevention Research Center Universitas Gadjah Mada.
Chahar, M.K., Sharma, N., and Joshi, Y.C. 2011. Flavonoids: A versatile source of anticancer drugs. Pharmacognosy Review. Jan-Jun; 5(9): 1-12.
Deng, L., Lin-Lee, Y.C., Claret, F.X. and Kuo, M.T. 2001. 2-
Acetylaminofluorene Up-regulates Rat mdr1b Expression through Generating Reactive Oxygen Species That
Activate NF-κB Pathway.J.Biol.
Chem.276 (1),413–420.
DeVita, V.T., Theodore, S.L. and Steven A.R. 2011. Cancer Principles and Practice of Oncology, 9th edition. Wolters Kluwer. Lippinot Williams and Wilkins. USA.
Fajriani, H.Q. 2013. Penentuan Aktivitas Antioksidan Kulit Buah Naga Super Merah (Hylocereus costarioensis) dan produk olahannya berupa permen jelly.Skripsi. Jakarta: Universitas Pendidikan Indonesia, hal 1-5.
Fortugno, P., Wall, NR., Giodini, A., 2002. Survivin Exists in Immunochemically Distinct
Subcellular Pools and is Involved in Spindle Microtubule Function.J Cell Sci. 115: 85-575.
Gibbs, J.B. 2000. Anticancer Drug Targets: Growth Factor and Growth Factor Signaling.J. Clin. Inves.105 (1): 9-13.
Jamilah, B., Shu, C. E., Kharidah, M.,Dzulkifly, M. A., and Noranizan, A.2011. Physico-chemical
Characteristics of Red Pitaya (Hylocereus lemairei) Peel. Int. Food. Res. J. 18: 279-286.
King, R. J. B. 2000. Cancer Biology, 2nd edition, Pearson Education Limited. London.
Kitagawa, S. 2006. Inhibitory Effect of Polyphenols on P-Glycoprotein-Mediated Transport.Biol. Pharm. Bull.29(1):1-6.
Mitasari, A. 2012. Uji Aktivitas Ekstrak Kloroform Kulit buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus Britton & Rose) Menggunakan Metode DPPH (1,1-Defenil-2-Pikril Hidrazil). Skripsi.Pontianak: Program Studi
Farmasi.Universitas Tanjungpura. Hal. 51; 68.
Nurliyana, R., Syed Z. I., Mustapha S.K., Aisyah, M. R., dan Kamarul R. K. 2010. Antioxidant study of pulp and peel dragon fruits: a comparative study. Int. Food. Res. J. 17:365-375.
Putra, T. U. 2012. Uji Aktivitas Ekstrakn-Heksana Kulit buah Naga Merah(Hylocereus polyrhizus Britton & Rose)Menggunakan Metode DPPH (1,1-Defenil-2-Pikril Hidrazil). Skripsi.Pontianak: Program Studi
Farmasi,Universitas Tanjungpura. Hal. 52.
Reuter, S., Eifes, S., Dicato, M., Aggarwal, B.B., and Diederich, M. 2008. Modulation of Anti-apoptotic and Survival Pathways by Curcumin as a Strategy to Induce Apoptosis in Cancer Cells.Biochemical
Pharmacol.76: 1340–1351.
Ricci, M.S., and Zhong, W.X. 2006. Chemotherapeutic Approaches for Targetting Cell Death Pathways.The Oncologist.11:342-357.
Romadhona, A. 2012. Uji Aktivitas Ekstrak Etanol Kulit buah Naga Merah (Hylocereus polyrhizus Britton & Rose) Menggunakan Metode DPPH (1,1-Defenil-2-Pikril Hidrazil). Skripsi.
Pontianak: Program Studi Farmasi. Universitas Tanjungpura. Hal. 51.
Ruddon, R.W. 2007.Cancer Biology, Fourth Edition. Oxford University Press.
Sastrohamidjojo, H., 2007. Spektroskopi. Edisi Kedua. Penerbit Liberty. Yogyakarta
Shan D. Z., Seng J. F., Pi C. N., Yuan L.G. and Gang Z. C. 2008. Isolation and Identification of an Anti-tumor Component from Leaves of Impatiens balsamina. Molecules. 13. 220-229.
Simstein, R., Burow, M., Parker, A., Weldon, C., and Beckman, B. 2003. Apoptosis, Chemoresistance, and Breast Cancer: Insights from the MCF-7 Cell Model System, Experimental Biology and Medicine.228: 995-1003.
Singh, N. 2007. Apoptosis in Health and Disease and Modulation of Apoptosis for Therapy: An Overview, Indian J. of Clin. Biochemistry.22 (2): 6-16.
97
Discussion and feedback