ISSN: 2597-8012    JURNAL MEDIKA UDAYANA, VOL. 8 NO.11,NOPEMBER, 2019

DOAJ


DIRECTORY OF OPEN ACCESS JOURNALS


€> ≤Γ∏ca.


OPTIMASI DETEKSI GEN E6 PADA HUMAN PAPILLOMAVIRUS RISIKO TINGGI DENGAN POLYMERASE CHAIN REACTION

I G A Aristi Dhika Pranani.1, Made Agus Hendrayana2, Komang Januartha P. Pinatih.3

1Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Udayana 2,3Departemen Mikrobiologi Klinis Fakultas Kedokteran Universitas Udayana

Jalan PB Sudirman, Denpasar, Bali Email: gustyadhip15@gmail.com ABSTRAK

Kanker servik merupakan jenis kanker pada wanita dengan angka kejadian terbesar keempat di dunia. Infeksi oleh human papillomavirus (HPV) adalah salah satu faktor penyebab kanker servik. HPV memliliki gen E6 yang berperan dalam patogenesis kanker servik, sehingga dijadikan target deteksi. Maka dari itu, tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi HPV secara cepat dan akurat secara molekular menggunakan teknik polimerase chain reaction (PCR). Metode yang digunakan adalah metode optimasi pada suhu penempelan DNA (annealing). Pada penelitian ini dilakukan optimasi deteksi pada gen E6 dari DNA HPV tipe 16. Optimasi dilakukan dengan menggunakan tiga variasi suhu annealing. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini yaitu suhu annealing optimal untuk mengamplifikasi gen E6 pada HPV tipe 16 adalah 5571C - 59 71C . Hasil optimasi suhu annealing tersebut memberikan hasil pita yang tebal dan spesifik sebesar 476 bp sesuai dengan ukuran pita gen E6 pada HPV tipe 16.

Kata Kunci: deteksi, optimasi PCR, Human Papillomavirus, kanker servik

ABSTRACT

Cervical cancer is 4th largest cancer incidence rate in women in the world. One of the causing factor of cervical cancer is infected by human papillomavirus. The oncoprotein E6 of HPV has a role in the progression of cervical cancer, making it a target for detection. The goals from this reasearch is to detect of HPV rapidly and accurately by using polymerase chain reaction (PCR) technique. We use the method of optimization of PCR annealing temperature on E6 genes from DNA HPV type 16. Optimization was performed using three variations of the attached DNA temperature (annealing). The results obtained from this study are the most optimal annealing temperature to amplify the E6 gene on HPV type 16 is 5571C - 5971C . The optimization results give thick and specific band result of 476 bp according to the band size of E6 HPV gene.

Keywords: detection, PCR optimization, Human Papillomavirus, cervical cancer

PENDAHULUAN

Kanker servik merupakan salah satu penyakit yang termasuk pada penyakit menular secara seksual.1 Di dunia, kanker berkontribusi sebagai penyebab mortalitas tertinggi kedua sebanyak 13% dari keseluruhan 22% mortalitas disebabkan penyakit tidak menular.2 Diseluruh dunia, kanker servik adalah jenis kanker pada wanita dengan angka kejadian terbesar keempat. Sebanyak 527.624 kasus kanker servik baru ditemukan, dengan angka kematian sebanyak 265.672 kasus setiap tahunnya. Kasus kanker servik dengan angka kejadian tertinggi ditemukan di negara berkembang.3 Di wilayah Asia Tenggara, kasus kanker servik sebanyak 50.566, dengan angka kematian sebanyak 23.989 kasus

setiap tahunnya. Di negara berkembang, kanker servik merupakan kanker terbanyak kedua setelah kanker payudara dengan jumlah kasus sebanyak 445.000.4 Persoalan mengenai kanker di Indonesia adalah sekitar 70% pasien kanker servik merupakan pasien kanker stadium lanjut.2 Infeksi Human Papillomavirus (HPV) merupakan penyebab utama kejadian kanker servik, disamping adanya ko-faktor yang lain, seperti : merokok, peningkatan jumlah pasangan seksual, dan penggunaan kontrasepsi secara oral.5,6

Pada proses infeksi oleh HPV gen onkogen E6 berperan utama dalam patogenesis kanker. Onkogen E6 berperan dalam mengganggu siklus sel melalui inaktivasi tumor

DOAJ


DIRECTORY OF OPEN ACCESS JOURNALS


C7*≤f∏ta


suppressor protein, yaitu p53, serta memfasilitasi replikasi virus.7 Terjadi perubahan pada sel epitel servik dimana siklus sel normal terganggu dan menghasilkan sel yang abnormal yang mengandung materi genetik virus.8 Ekspresi berlebihan dari gen E6 sangat berkaitan dengan perkembangan kanker serviks.9 Karena perannya yang sentral dalam pathogenesis HPV, gen E6 sering digunakan sebagai target deteksi, terapi dan pengembangan vaksin.

Pendekatan dalam mendeteksi pajanan HPV adalah secara biologi molekuler menggunakan PCR. Pemeriksaan dengan PCR memiliki akurasi yang tinggi dan dapat menentukan sampai pada tingkat gen.10 Optimasi PCR pada gen E6 pada HPV tipe 16 dilakukan agar deteksi HPV dapat dilakukan dengan lebih cepat dan penanganan medis lebih lanjut dapat dilakukan.

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini menggunakan sampel berupa DNA HPV tipe 16 yang terisolasi dari jaringan kanker servik. Pada proses PCR menggunakan PCR mix yang terdiri dari Promega Master Mix, primer E6 forward: 5’-GAA ACC GGT TAG TAT AAA AGC AGA C-3’, primer E6 reverse: 5’-AGC TGG GTT TCT CTA CGT GTT CT-3’ 11, H2O, dan template DNA. Bahan untuk proses elektroforesis berupa gel agarosa 1,5%, TBE 1x dan marker berukuran 100 bp.

Amplifikasi Gen E6 HPV tipe 16

Pada amplifikasi gen E6, campuran PCR yang digunakan memiliki volume total 10 ,Lil! . Formulasi PCR dilakukan dengan mencampurkan Promega Master Mix 5 P^ , masing-masing primer 0.5 ^ , DNA template 0.5 μi, dan H2O 3.5 μ/ .

Proses optimasi PCR yang pertama dilakukan dengan tahap pra denaturasi suhu 9SυC dalam 2 menit, denaturasi suhu 9?C dalam 1 menit, penempelan primer dalam 45 detik dengan suhu 53 'C , pemanjangan primer (extension) suhu 7 2", C selama 1 menit, final extension suhu 7 2y C selama 5 menit. Pengulangan siklus dilakukan sebanyak 35 kali. PCR kedua menggunakan suhu penempelan primer (annealing) 55αt dengan proses lainnya sama dengan PCR pertama. PCR ketiga menggunakan suhu annealing 59 1L dengan proses lainnya sama dengan PCR pertama. Running PCR menggunakan 2 tube : 9,5 pi untuk tube 1 ditambahakan sample DNA 0,5 p/ dan 9,5 1ll∣! untuk tube 2 sebagai kontrol negatif.

Hasil produk PCR divisualisasikan dengan menggunakan teknik elektroforesis untuk melihat keberhasilan dari amplifikasi gen. Elektroforesis dilakukan dengan gel agarosa 1,5% (dalam TBE 1x) yang diwarnai dengan Gelred 1 1ll∣! . Running elektroforesis dilakukan dengan TBE buffer 0.5x pada tegangan 100 Volt selama 35 menit. Hasil elektroforesis kemudian divisualisasikan dengan transiluminator ultra violet. Produk PCR Gen E6 normal adalah berukuran 476 bp.

HASIL

Gambar 1. Produk PCR Hasil Amplifikasi Gen E6 HPV Tipe 16

Pada gambar 1 produk PCR gen E6 HPV tipe 16 menggunakan suhu annealing 53αt (1 sebagai kontrol negatif, 2 sebagai sampel), 55 1C (3 sebagai sampel, 4 sebagai kontrol negatif), dan 59 αt (5 sebagai sampel, 6 sebagai kontrol negatif) yang dielektroforesis pada 1,5% gel agarosa; M sebagai Marker DNA ladder 100bp. Pita DNA menunjukkan hasil yang positif pada ketiga variasi suhu yang digunakan, seperti ditunjukkan pada gambar 1 lane 2, 3, dan 5. Pada kondisi suhu 53 "6 , masih terdapat gambaran multiple band pada produk hasil PCR. Pada suhu 55 "6 , dan 59 αt yang memberikan gambaran pita DNA tebal dan spesifik berukuran 476 bp. Pada lane 1, 4, dan 6 (kontrol negatif) dari masing masing suhu 53 αt , 55αt , dan 59αt , memperlihatkan pita primer dimer pada produk hasil PCR.

PEMBAHASAN

Berdasarkan hasil visualisasi produk PCR, pada suhu 53 αt (lane2), masih terdapat gambaran multiple band DNA yang berukuran selain 476 bp. Hal ini disebabkan oleh suhu annealing yang rendah, sehingga primer menempel template DNA lainnya.12 Pada lane 1,4, dan 6 terdapat produk pita tidak spesifik yang disebut primer dimer yang disebabkan oleh

DOAJ


DIRECTORY OF OPEN ACCESS JOURNALS


C7*≤f∏ta


tidak adanya DNA yang dicampurkan atau tingginya konsentrasi primer yang digunakan.12

Gambar 1 lane 3 dan 5 memperlihatkan visualisasi produk PCR pada suhu 55 "6 dan 59αt tampak sangat jelas dan memiliki ukuran pita yang sesuai. Hasil ini berkaitan dengan penelitian Pande yang menggunakan suhu annealing yang sama yaitu 55flC .11 Pertimbangan lainnya adalah perhitungan suhu annealing berdasarkan suhu leleh (Tm) primer. Berdasarkan perhitungan Tm dengan rumus; Tm = 2(A+T) + 4(G+C) didapatkan Tm F sebesar 7011C dan Tm R sebesar 68"6 . Tm akhir primer sebesar 69"6 . Suhu annealing yang digunakan umumnya 10nC dibawah Tm primer yaitu 59flC .

Produk PCR yang menggunakan suhu annealing 55nC dan 59 αt menunjukkan panjang basa berukuran 476 bp. Pada penelitian ini, hasil optimasi gen menunjukan pada suhu 55 "6 -59 αt memberikan amplifikasi yang terbaik sehingga menghasilkan pita amplifikasi gen E6 HPV tipe 16 yang tebal dan spesifik.

SIMPULAN

Suhu annealing optimal untuk mengamplifikasi gen E6 pada HPV tipe 16 adalah 55"C - 59λ'C .

DAFTAR PUSTAKA

  • 1      Ibeanu OA. Molecular pathogenesis of

cervical cancer. Cancer Biol Ther 2011; 11: 295–306.

  • 2      Oemiati R, Rahajeng E, Kristanto AY. Di

Indonesia penyakit. Badan Penelit dan Pengemb Kesehatan,    Kementrian

Kesehat Indones 2011.

  • 3      Human Papillomavirus and Related

Diseases Report. J Infect Dis 2016; 202: 1789–1799.

  • 4      Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R,

Eser S, Mathers C, Rebelo M et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer 2015; 136: E359–E386.

  • 5     Gómez DT, Santos JL. Human

Papillomavirus Infection and Cervical Cancer: Pathogenesis and Epidemiology. Appl Microbiol 2007; : 680–688.

  • 6     Wang SS, Zuna RE, Wentzensen N,

Dunn ST, Sherman ME, Gold MA et al. Human papillomavirus cofactors by disease progression and human papillomavirus types in the study to understand cervical cancer early endpoints and determinants. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev 2009; 18:

113–120.

  • 7     Münger K, Baldwin A, Edwards KM,

Nguyen CL, Owens M, Huh K et al. Mechanisms of Human MINIREVIEW Mechanisms of Human Papillomavirus-Induced Oncogenesis. J Virol 2004; 78: 11451–11460.

  • 8      World      Health      Organization.

Comprehensive     cervical     cancer

prevention and control: a healthier future for girls and women. World Heal Organ 2013; : 1–12.

  • 9     Monsonego J, Cox JT, Behrens C, Sandri

M, Franco EL, Yap PS et al. Prevalence of high-risk human papilloma virus genotypes and associated risk of cervical precancerous lesions in a large U.S. screening population: Data from the ATHENA trial. Gynecol Oncol 2015; 137: 47–54.

  • 10    Kocjan BJ, Bzhalava D, Forslund O,

Dillner J, Poljak M. Molecular methods for identification and characterization of novel papillomaviruses. Clin Microbiol Infect 2015; 21: 808–816.

  • 11     Pande S, Jain N, Prusty BK, Bhambhani

S, Gupta S, Sharma R et al. Human papillomavirus type 16 variant analysis of E6, E7, and L1 genes and long control region in biopsy samples from cervical cancer patients in North India. J Clin Microbiol 2008; 46: 1060–1066.

  • 12    Gonzalez-Martinez A, Rodriguez-

Sanchez A, Rodelas B, Abbas BA, Martinez-Toledo MV, Van Loosdrecht MCM et al.   454-Pyrosequencing

Analysis of Bacterial Communities from Autotrophic     Nitrogen     Removal

Bioreactors Utilizing Universal Primers: Effect of Annealing Temperature. Biomed           Res           Int

2015;2015.doi:10.1155/2015/892013.

https://ojs.unud.ac.id