ISSN: 2303-1395                  E-JURNAL MEDIKA, VOL. 8 NO.1,Januari, 2019

Il——∖ λ ∣directoryof OPEN ACCESS IJOURNALS

IDENTIFIKASI SUBTIPE Enterotoxigenic Escherichia coli DAN Enteroaggregative Escherichia coli DARI SPESIMEN USAP DUBUR PENJAMAH MAKANAN DI DENPASAR MENGGUNAKAN POLYMERASE CHAIN REACTION

D A Indah Gitaswari1, Sri Budayanti2

1Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Udayana

2

Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana

ABSTRAK

Penjamah makanan atau food handler memiliki risiko paling tinggi untuk terpapar penyakit yang disebabkan oleh bakteri. Penjamah makanan dapat bertindak sebagai carrier penyakit infeksi seperti demam tifoid, hepatitis A, dan diare. Hal ini disebabkan karena kurangnya kemampuan dari penjamah makanan dalam menjaga kebersihan. Bakteri patogen tersering sebagai penyebab diare adalah Escherichia coli yang diperkirakan sebagai penyebab 1.5 juta kematian per tahun. Bakteri Escherichia coli memiliki beberapa subtipe penyebab diare yang disebut Diarrheagenic Escherichia Coli  (DEC) diantaranya adalah  Enterotoxigenic  Escherichia  coli  (ETEC),

Enteropathogenic  Escherichia coli (EPEC),  Enteroinvasive  Escherichia  coli  (EIEC),

Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC), Vero toxin-producing/Shiga toxin-producing Escherichia coli (VTEC/STEC), Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) dan Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) paling sering sebagai penyebab diare. Saat ini prevalensi subtipe Escherichia coli sebagai penyebab diare di Bali masih belum diketahui secara pasti. Untuk melihat prevalensi tersebut, pada penelitian ini akan diteliti tipe ETEC dan EAEC dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) unipleks. Sampel merupakan isolat Escherichia coli dari spesimen usap dubur penjamah makanan di Denpasar tahun 2015. Gen target untuk identifikasi ETEC dan EAEC adalah CVD432 (630 bp), LT (273 bp), dan STh (120 bp). Program PCR yang digunakan pada tahap pre denaturasi 95◦C, denaturasi 95◦C, suhu annealing 55◦C, ekstensi 72◦C, dan final ekstensi 72◦C. Hasil penelitian didapatkan bahwa prevalensi bakteri Escherichia coli menunjukkan 40% memiliki hasil yang positif terhadap gen ETEC atau EAEC. Dari 40% sampel positif, 31,4% merupakan subtipe EAEC; 5,7% subtipe ETEC; dan 3% memiliki kedua gen yaitu ETEC dan EAEC.

Kata kunci: Polymerase Chain Reaction, Enteroaggregative Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli

ABSTRACT

Food handler is a position that has the highest risk to get an exposure from any bacterial disease. Food handler can be act as the carrier for kind of infectious diseases such as typhoid fever, Hepatitis A, and diarrhea. It caused by the lack of their capability in maintain their cleanliness. The most causative pathogen of diarrhea is Eschericia colithat estimated to contribute in 1.5 billion of deaths each year. Eschericia coli has some subtypes as the etiology of diarrhea disease which called Diarrheagenic Escherichia Coli (DEC), sort of them are Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Enteropathogenic  Escherichia  coli  (EPEC),  Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC),

Enteroaggregative Escherichia  coli  (EAEC),  Vero toxin-producing/Shiga  toxin-producing

Escherichia coli (VTEC/STEC),and Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) are merely accounted as the cause of diarrhea. However, epidemiologic data about the prevalence subtypes of Escherichia coli as the diarrhea pathogen in Bali is unclear. In the present study, we identified ETEC and EAEC subtypes using Polymerase Chain Reaction (PCR) uniplex. Sample used is an isolate of Escherichia coli from rectal swab specimen of food handler in Denpasar at year 2015. The gene target to identify ETEC and EAEC are CVD432 (630 bp), LT (273 bp), andSTh (120 bp). PCR program that used was in the pre-denaturation phase 95◦C, denaturation 95◦C, annealing temperature55◦C, extension 72◦C, and extension final 72◦C. Result shows the prevalence of Escherichia coli is 40%

Il——∖ λ ∣directoryof OPEN ACCESS IJOURNALS

positive of bacteria from total gene from ETEC and EAEC. Respectively, from 40% positive sample, 31.4% is EAEC subtype; 5.7% ETEC subtype; and 3% having both ETEC and EAEC subtypes.

Keywords: Polymerase Chain Reaction, Enteroaggregative Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli

PENDAHULUAN

Makanan merupakan kebutuhan pokok yang penting bagi manusia. Namun saat ini melalui makanan dapat menimbulkan masalah, salah satunya adalah penyakit yang dapat disebarkan melalui makanan seperti diare atau keracunan makanan. Penelitian yang dilakukan di beberapa Negara industri menunjukkan lebih dari 60% food borne disease disebabkan karena buruknya kemampuan penjamah makanan atau food handler untuk mengolah makanan1. Bakteri dan parasit lebih sering menyebabkan diare dibandingkan virus di beberapa Negara berkembang. Bakteri pathogen tersering penyebab diare adalah Escherichia coli, Shigella, Campylobacter dan Salmonella bersama dengan Vibrio cholera2. Diarrheagenic Escherichia coli (DEC) merupakan penyebab diare tersering dan memiliki beberapa subtipe. Masing-masing subtipe Escherichia coli yang dapat menyebabkan diare dilihat berdasarkan faktor virulen spesifik dan fenotipnya. Subtipe DEC diantaranya adalah Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) sebagai penyebab diare pada traveler, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) yang tergolong jarang menyebabkan diare pada orang dewasa dan sering menyerang anak-anak dibawah dua tahun, Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) sebagai penyebab diare yang disertai demam, Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) sebagai penyebab watery diarrhea pada anak dan

diare persisten pada anak immunodeficiency    virus

toxinproducing/     Shiga

Escherichia         coli

dengan human (HIV),     Vero

toxin-producing (VTEC/STEC),


Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)

sebagai penyebab diare berdarah, hemorrhagic colitis berat, dan hemolytic uremic syndrome pada 6-8% kasus, dan yang terakhir adalah diffusely adherent Escherichia coli (DAEC) 3.

Adanya beberapa tipe Escherichia coli yang sudah resisten terhadap beberapa antibiotik menyebabkan pemilihan antibiotik merupakan hal yang krusial mengingat beberapa komplikasi dapat ditimbulkan pada infeksi diarrhaegenic Escherichia coli (DEC) seperti anemia hemolitik, trombositopenia, dan gagal ginjal akut. Disamping itu, penggunaan antibiotik yang tidak tepat dapat meningkatkan produksi toksin pada beberapa tipe dari DEC tersebut, seperti pada peningkatan

produksi Shig-toxins (Stx) dapat memperburuk hemolytic uremic syndrome (HUS) dan menimbulkan komplikasi. Prevalensi subtipe Escherichia coli sebagai penyebab diare di Bali masih belum diketahui secara pasti. Infeksi dengan beberapa tipe dari DEC dapat menyebabkan akibat yang fatal terutama pada anakanak dan usia lanjut karena dapat menyebabkan beberapa komplikasi seperti hemolytic uremic syndrome (HUS) dan hemorrhagic colitis (HC)3.

Identifikasi beberapa jenis DEC memiliki keuntungan dalam pengobatan bagi pasien diare dengan menggunakan beberapa pemeriksaan molekuler, salah satunya adalah Polymerase Chain Reaction (PCR)4. Melihat permasalahan tersebut, maka pengenalan subtipe Escherichia coli ini menjadi penting terutama untuk menentukan jenis pengobatan yang akan dilakukan5. Karena keterbatasan penelitian dan melihat prevalensi subtipe yang saat ini mendominasi, penelitian hanya dilakukan untuk mengidentifikasi    dua    subtipe    dengan

menggunakan metode PCR unipleks. Dua subtipe Escherichia coli tersebut adalah tipe ETEC dan EAEC.

BAHAN DAN METODE

Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif dengan pendekatan cross sectional study. Populasi target adalah seluruh bakteri yang terisolasi dari penjamah makanan di Denpasar. Populasi terjangkau yang dimaksud dalam penelitian ini adalah bakteri coliform yang terdapat dari usap dubur penjamah makanan di Denpasar. Penelitian ini menggunakan teknik Total Sampling. Sampel adalah isolat bakteri Escherichia coli dari penjamah makanan di Denpasar pada tahun 2015.

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan     Laboratorium      Biologi

Molekuler Fakultas  Kedokteran  Universitas

Udayana, pada bulan Maret sampai Oktober 2015. Pengambilan Koloni dan Isolasi DNA E.coli

Sampel dalam bentuk padat dilakukan striking 4 kuadran pada plate Mac Conkey (MC), dikultur dalam waktu 18-24 jam pada suhu 37oC. Sampel kemudian dikonfirmasi dengan pengecatan gram, uji katalase, dan uji biokimia, lalu dimasukkan kedalam Phosphate Buffer Saline (PBS). Isolasi DNA dilakukan dengan metode boiling selama 10 meniit sejumlah 10 mL yang sudah dilarutkan

I—∖/—∖ λ ∣directoryof OPEN ACCESS IJOURNALS dengan buffer TE pada suhu 99oC. Selanjutnya suspensi disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm untuk didapatkan DNA murni. DNA disimpan dalam suhu -20◦C digunakan sebagai template pada PCR.

PCR untuk Mendeteksi Gen ETEC dan EAEC pada E. coli

DNA murni dimasukkan dalam program PCR dengan mencampur ReadyMix dan taq polymerase dengan primer ETEC dan EAEC sebagai produk PCR. PCR unipleks untuk mendeteksi gen EAEC menggunakan primer CVD432; Forward: 5’-CTG GCG AAA GAC TGT ATC AT-3’ & Reverse: 5’-

Gambar 4. Hasil elektroforesis pada target gen dan elt


HASIL


AAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T-3’.

Deskripsi Karakteristik Sampel

Mendeteksi gen ETEC dengan produk gen LT menggunakan primer elt Forward: 5’-ACG GCG TTA CTA TCC TCT C-3’ & Reverse: 5’ TGG TCT CGG TCA GAT ATG TG-3’. Gen ETEC juga dapat dideteksi dengan primer estA2-4; Forward: 5’-TTC ACC TTT CCC TCA GGA TG-3’ & Reverse: 5’-CTA TTC ATG CTT TCA GGA CCA-3’. 7

Pada 35 isolat Escherichia coli, didapatkan 14 (40%) sampel yang positif terdapat gen ETEC maupun EAEC. Gen EAEC positif pada target gen CVD432 sebesar 630 bp6. Gen ETEC dengan produk gen LT positif pada target gen elt sebesar 273 bp7. Gen ETEC dengan produk gen Sth positif pada target gen estA2-4 sebesar 120 bp7.

Suhu annealing yang ditetapkan adalah 55oC. Volume reaksi akhir sebanyak 10μL mengandung 0,8μL template DNA, MasterMix Kappa Biosystem 5μL, H2O 3,2μL, primer forward 0,5μL dan primer reward 0,5μL.

Elektroforesis

Masing-masing 2 μL produk PCR diambil untuk elektroforesis dengan tegangan listrik 50 volt selama 60 menit. Gambaran hasil dibaca dengan Gel-Doc Bio-Rad.

Gambar 3. Hasil elektroforesis pada target gen pCVD432 dan elt

Tabel 2. Hasil PCR pada 35 sampel spesimen

usap dubur sebagai karier Escherichia coli di Denpasar tahun 2015

Subtipe

Target Gen

Jumlah

CVD432

11

estA2-4

1

elt

1

estA2-4 dan elt

-

est A2-4 dan

CVD432

elt dan CVD432

-

estA2-4, elt, dan

CVD432

1

Negatif

21

Total

35

Dari tabel didapatkan bahwa 14 (40%) dari sampel menunjukkan hasil positif terhadap gen ETEC dan EAEC. Gen EAEC memiliki prevalensi tertinggi dari total sampel yang positif yaitu sebanyak 11 (31,4%) sementara untuk gen ETEC hanya 2 (5,7%). Pada penelitian ini didapatkan 1 sampel (3%) positif pada ketiga primer.

Gambar 6. Contoh hasil positif pada target gen EAEC primer pCVD432 positif pada 10R,11R, 12R, 13R, 14R dengan panjang pita 630 bp

Gambar 7. Contoh hasil positif pada primer elt pada 11R dengan panjang pita 273bp

Gambar 8. Contoh hasil positif primer est pada 11R dengan panjang pita 120 bp

Gambar 9. Contoh hasil positif pada dupleks terlihat pada kedua primer yaitu est dan elt pada sampel 11R.

Ini menunjukkan sampel 11R positif pada gen ETEC dan EAEC.

PEMBAHASAN

Deteksi subtipe spesifik pada diarrheagenic Escherichia coli saat ini dilakukan akibat outbreak infeksi diare di beberapa negara. Adanya overlap pada target gen, dimana ada satu sampel memiliki dua jenis gen dan gejala pada subtipe Escherichia

coli yang berbeda dapat menyulitkan Identifikasi. Beberapa subtipe Escherichia coli yang resisten terhadap beberapa antibiotik menyebabkan pemilihan antibiotik merupakan hal yang krusial mengingat beberapa komplikasi dapat ditimbulkan pada infeksi diarrhaegenic Escherichia coli (DEC) seperti anemia hemolitik, trombositopenia, dan gagal ginjal akut. Disamping itu, penggunaan antibiotik yang tidak tepat dapat meningkatkan produksi toksin pada beberapa tipe dari DEC tersebut, seperti pada peningkatan produksi Shig-toxins (Stx) dapat memperburuk hemolytic uremic syndrome dan menimbulkan komplikasi. PCR merupakan salah satu metode biologi molekuler yang memiliki sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi dalam mendeteksi target DNA. Metode PCR dapat digunakan untuk mendeteksi gen virulen pada DEC6.

Pada penelitian ini dalam mendeteksi subtipe DEC dari bakteri yang sudah dikultur pada usap dubur penjamah makanan menggunakan metode PCR unipleks dan dupleks. PCR unipleks sangat baik digunakan untuk mengidentifikasi subtipe dari DEC pada penelitian ini yaitu ETEC dan EAEC karena marker virulen pada kedua tipe bisa terlihat dengan jelas.

Penelitian yang dilakukan oleh Hedge, A di Manipal University, India dengan menggunakan metode PCR ditemukan bahwa total 52 (26%) dari total 200 sampel feses diare pada anak-anak merupakan DEC. Prevalensi subtipe DEC pada PCR terdeteksi yakni pada gen EAEC memiliki prevalensi tertinggi yaitu 26,13% sedangkan untuk EAEC hanya 7%, sisanya diikuti oleh subtipe DEC yang lain dari total sampel7. Penelitian yang sama juga dilakukan di Kenya pada anak-anak dibawah 5 tahun dengan HIV menunjukkan bahwa dari 36 bakteri patogen yang teridentifikasi, EAEC memiliki prevalensi tertinggi yaitu 58,3%, sementara ETEC hanya 5,6%8. Hasil yang didapat peneliti dengan menggunakan metode single PCR saat ini dari 35 sampel spesimen usap dubur pada penjamah makanan di Denpasar, 14 (40%) diantaranya teridentifikasi terdapat bakteri yang patogen. EAEC memiliki prevalensi tertinggi yaitu 11 (31,4%), dan untuk subtipe ETEC hanya 2 (5,7%). Ini menunjukkan hasil yang sama pada prevalensi yang dilakukan pada penelitian sebelumnya.

Tipe ETEC memiliki prevalensi yang lebih rendah dibandingkan dengan EAEC disebabkan oleh eksotoksin yang dihasilkan oleh ETEC yaitu heat-labile exotoxin (LT) merangsang pembentukan antibodi. LT membentuk antibodi penetralisasi dalam serum dan memungkinkan juga pada lumen usus pada penderita infeksi akibat ETEC. Sehingga, pasien pada daerah dengan prevalensi ETEC tinggi seperti pada

I——∖ λ ∣directoryof OPEN ACCESS IJOURNALS negara berkembang kemungkinan besar telah memiliki antibodi dan tidak mudah mengalami diare apabila terpapar ulang oleh Escherichia coli penghasil eksotoksin LT9.

SIMPULAN

Pada penelitian ini peneliti masih terbatas pada penggunaan metode PCR unipleks dalam mengidentifikasi subtipe dari Diarrheagenic Escherichia coli. Didapatkan prevalensi bakteri Escherichia coli yang positif pada penjamah makanan sebagai karier adalah 40%. Dari 40% tersebut, subtipe EAEC memiliki prevalensi tertinggi yaitu sebanyak 31,4%, subtipe ETEC memiliki prevalensi 5,7% dan satu bakteri memiliki kedua gen yaitu ETEC dan EAEC dengan prevalensi 3%.

Kelemahan dari penelitian ini adalah diperlukannya sampel yang lebih banyak untuk mendeteksi subtipe dari DEC. Diharapkan pada penelitian ini dapat menggunakan jumlah sampel yang lebih besar.

Daftar Pustaka

  • 1.    Puspita I, Palandeng H, Sinolungan J. “Hubungan Praktik Higiene Sanitasi Penjamah Makanan Terhadap Cemaran Escherichia coli Pada Makanan Gado-gado Di Sepanjang Jalan Kota Manado,” Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Sam Ratulangi. 2013

  • 2.    Aslani MM, Alikhani MY, Zavari A, dkk. “Characterization of enteroaggregative Escherichia

coli (EAEC) clinical isolates and their antibiotic resistance pattern,” Elsevier International Journal of Infectious Disease. 2010:136-139.

  • 3.    Vinamont I. “Clinical relevance of diarrhaegenic E.coli detection: A distinction between toxin producing diarrhaegenic E.coli and diarrhaegenic E.coli type that cause a sellf-inflicted immune respone,” Utrecht University. 2013.

  • 4.    Arisman. “Buku Ajar Ilmu Gizi Keracunan Makanan,”. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. 2009

  • 5.    Toma C, Yan Lu, Higa N, dkk. “Multiplex PCR Assay for Identification of Human Diarrhaegenic Escherichia coli,” Journal of Clinical Microbiology. 2003:2669-2671.

  • 6.    Hedge A, “Detection of diarrheagenic Escherichia coli by multiplex PCR,” Indian Journal Medical Microbiology. 2012

  • 7.    Tobias J,Vutukuru, SR. “Simple and rapit multiplex PCR for identification of the main human diarrheagenic Escherichia coli,” Elseiver Microbiological Research. 2012:564-570.

  • 8.    Rono SJ, Kakai R, Esamai F, dkk. “Patothypes and Virulence Markers in Escherichia coli Associated with Diarrhoea Among HIV Seropositive and Seronegative Children Below Five Years in Western Kenya,” European Scientifiv Journal. 2014:10:27.

  • 9.    Brooks. GF, Carroll KC., Butel, JS dkk. “Mikrobiologi Kedokteran” Edisi 25. Jakarta: Penerbut Buku Kedokteran EGC. 2013

https://ojs.unud.ac.id/index.php/eum

11