ISSN: 2303-1395 E-JURNAL MEDIKA, VOL. 8 NO.2,Februari,

2019

Il—∖λλ λ ∣directoryof

OPEN ACCESS I__f∖^Jf—∖U JOURNALS

Studi Molekuler Gen Penyandi Enzim Extended Spectrum β-

Lactamase (ESBL), β-Lactamase AmpC, dan Karbapenemase pada Isolat Klinis Multi-drug Resistant (MDR) Klebsiella pneumoniae di RSUP Sanglah, Denpasar

GNR Suwardana^1*, NMA Tarini², NND Fatmawati²

1. Program Studi Pendidikan Dokter FK UNUD
2. Departemen/SMF Mikrobiologi Klinik FK UNUD/RSUP Sanglah

* e-mail : rsi_suwardana@yahoo.com

ABSTRAK

Klebsiella pneumoniae adalah salah satu bakteri penyebab hospital acquired infections (HAIs) dengan angka morbiditas dan mortalitas yang tinggi. Tingginya beban kesehatan akibat infeksi K. pneumoniae utamanya diakibatkan oleh sifat resistensi terhadap banyak golongan antibiotik (multi-resisten), termasuk resistensi terhadap antibiotik golongan mutakhir seperti sefalosporin generasi ketiga dan karbapenem. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengonfirmasi keberadaan gen penyandi enzim Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL), β-Lactamase AmpC, dan karbapenamase pada isolat klinis multi-resisten K. pneumoniae. Lima isolat klinis multi-resisten K. pneumoniae terdeteksi secara fenotip menggunakan uji Vitek Compact 2 (Biomereux®), kemudian teknik polymerase chain reaction (PCR) digunakan untuk mendeteksi adanya gen blaSHV, blaTEM, blaCTX-M sebagai gen penyandi ESBL, blaFOX sebagai gen penyandi AmpC, dan blaKPC serta blaNDM-1 sebagai gen penyandi karbapenamase. Penelitian ini menemukan bahwa 4 dari 5 sampel positif memiliki gen penyandi ESBL, yakni 2 sampel dengan blaCTX-M, sedangkan 2 sampel lainnya didapatkan dual gen blaSHV dan blaTEM. Tidak ditemukan adanya gen penyandi AmpC maupun karbapenemase pada semua sampel. Sifat multi-resistensi pada isolat klinis K. pneumoniae kemungkinan diakibatkan karena adanya gen penyandi β-lactamase, sedangkan resistensi terhadap karbapenem kemungkinan besar terjadi bukan karena adanya gen penyandi karbapenemase, namun dimungkinkan adanya mekanisme resistensi yang lain.

Kata kunci : K. pneumoniae, multi-resistensi, ESBL, AmpC, karbapenemase

ABSTRACT

Klebsiella pneumoniae is type of bacteria that mainly caused hospital acquired infections (HAIs) with high morbidity and mortality. K. pneumoniae was termed as superbug due its multi-drug resistant profile to many common antibiotics, including the newest third generation of cephalosporin and carbapenem. This study was conducted to confirm the existence of resistance genes that encodes the Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) enzymes, β-Lactamase AmpC, and carbapenemase from clinical isolate multi-drug resistant K. pneumoniae. Five K. pneumoniae isolates with multi-drug resistant profiles were tested by Vitek Compact 2 (Biomereux®), then polymerase chain reaction (PCR) was used to detect blaSHV, blaTEM, blaCTX-M genes that produce ESBL enzyme, blaFOX for

2019

Il—∖/—∖ λ j Directoryof OPEN ACCESS I_√ JOURNALS

AmpC, blaKPC and blaNDM-1 genes for carbapenemase. This study found four samples were positive for ESBL genes (two samples with blaCTX-M and two with dual genes blaSHV and blaTEM). All samples were negative for blaFOX, blaKPC, dan blaNDM-1 genes. K. pneumoniae’s multi-drug resistant profile might caused by the existance of gene that produces β-lactamase. Meanwhile, there are another mechanisms for carbapenem-resistant K. pneumoniae, beyond the existance of gene that encodes carbapanemase.

Keywords : K. pneumoniae, multi-drug resistant, ESBL, AmpC, carbapenemase

PENDAHULUAN

Salah satu spesies bakteri yang menjadi penyebab utama kasus-kasus Hospital Acquired Infections (HAIs) adalah Klebsiella pneumoniae. Kasus HAIs akibat K. pneumoniae menjadi salah satu faktor risiko meningkatnya angka morbiditas dan mortalitas pasien, memperpanjang waktu perawatan dan menambah pengeluaran biaya perawatan (cost of expenditure). ^1,2

Tingginya beban kesehatan pada infeksi K. pneumoniae terjadi karena sifat resistensi terhadap banyak golongan antibiotik atau sering disebut multi-resisten (multi-drug resistant). Sifat resistensi yang dimiliki oleh K. pneumoniae umumnya disebabkan oleh enzim Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL), dan β-Lactamase AmpC yang mampu menghidrolisis antibiotik jenis β-Lactam.³

Pada beberapa kasus infeksi berat akibat K. pneumoniae penghasil ESBL atau AmpC, antibiotik yang menjadi

pilihan utama adalah karbapenem.²Namun, beberapa laporan klinis menyebutkan adanya sifat resistensi terhadap karbapenem akibat produksi enzim karbapenemase yang juga mampu menghidrolisis antibiotik golongan karbapenem.^4,5

Keberadaan enzim-enzim yang mampu menghidrolisis banyak golongan antibiotik sangat penting untuk dikonfirmasi baik secara fenotip dan genotip, utamanya menyangkut pilihan terapi yang efektif bagi pasien serta surveilans kesehatan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen-gen penyandi ESBL, AmpC, dan karbapenemase pada isolat klinis K. pneumoniae di RSUP Sanglah, Denpasar-Bali.

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen laboratorium dengan teknik potong lintang (crosssectional), dengan waktu penelitian

dimulai dari April hingga November 2015. Penelitian ini dilaksanakan di Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah dan Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana (FK UNUD).

Sampel pada penelitian ini menggunakan isolat K. pneumoniae dengan profil multi-resisten melalui uji Vitek Compact 2 (Biomeriux®) dari semua spesimen klinis yang diperoleh di Laboratorium Mikrobiologi Klinik

RSUP Sanglah tahun 2015. Sampel penelitian diambil dengan metode consecutive sampling dengan jumlah isolat yang ditemukan sebanyak 5 isolat. Sampel K. pneumonia dipastikan terlebih dahulu dengan mendeteksi gen 16s RNA, sedangkan gen resistensi yang diteliti pada penelitian ini yakni blaSHV, blaTEM, dan blaCTX-M sebagai penyandi ESBL, blaFOX sebagai penyandi AmpC, blaKPC dan blaNDM-1 sebagai penyandi gen karbapenamase.

Tabel 1. Deskripsi primer (16sRNA, blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaFOX, blaKPC, dan blaNDM-1).
Gen	Primer	Sequence Forward 5’→3’ Reverse 3’→5’	Annealing (waktu/suhu)	Panjang Basa (base pair)	Sitasi
	Forward	AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG		1,5 kilo bp
16s RNA	Reverse	ACG GHT ACC TTG TTA CGA CTT	30 detik/55 ^oC	1,5 kilo bp	6
	Forward	ATG CGT TAT ATT CGC CTG TG
Blashv	Reverse	AGC GTT GCC AGT GCT CGA TC	30 detik/55 ^oC	862 bp	7,8
	Forward	ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG
Blatem	Reverse	CCA ATG CTT ATT CAG TGA GG	60 detik/55 ^oC	858 bp	7,8
	Forward	SCS ATG TG CAGY ACC AGT AA
Blactx-m	Reverse	ACC AGA AYV AGC GGB GC	60 detik/55 ^oC	585 bp	7,8
	Forward	AAC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G
Blafox	Reverse	CAA AGC GCG TAA CCG GAT TGG	30 detik/55 ^oC	190 bp	9
	Forward	TCG AAC AGG ACT TTG GCG
Blakpc	Reverse	GGA ACC AGC GCA TTT TTG C	30 detik/55 ^oC	201 bp	10
	Forward	GCA TAA GTC GCA ATC CCC G
Blandm-1	Reverse	CTT CCT ATC TCG ACA TGC CG	30 detik/55 ^oC	237 bp	10

Isolasi DNA bakteri menggunakan kit High Pure Purification (Roche® Singapore), dan PCR dikerjakan menggunakan Go Green Taq (Promega®) sebanyak 35 kali siklus. Konsentrasi masing-masing primer forward dan reverse adalah 0,3 µL, sedangkan konsentrasi cetakan DNA yang digunakan sebesar 0,4 µL. Tahapan elektroforesis menggunakan agarose dengan konsentrasi 1%, selama 45 menit (Electrophoresis system, Mupid-Exu™).

HASIL

Kelima sampel isolat klinis K. pneumoniae (pus [n=2]; urin [n=2]; lain-lain [n=1]) dari Instalasi Mikrobiologi Klinis RSUP Sanglah memperlihatkan profil multi-resisten

secara fenotip dengan uji Vitek Compact 2 (Biomeriux®). Tiga dari lima sampel yang diteliti menunjukan profil positif penghasil ESBL dengan uji fenotip.

Uji genotip menggunakan PCR didapatkan bahwa kelima sampel menunjukan adanya pita (band) positif pada gen penyandi 16s RNA. Gen penyandi ESBL ditemukan positif pada empat dari lima sampel penelitian. Dua sampel menunjukan adanya co-existance antara gen blaSHV dan blaTEM, sementara gen tunggal blaCTX-M ditemukan positif pada dua sampel yang digunakan. Semua sampel menunjukan hasil negatif terhadap gen penyandi AmpC, dan karbapenemase (tabel 3).

Tabel 2. Profil Uji Sensitivitas Antibiotik Pada Isolat Klinis Multi-resistensi K. pneumoniae di Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah.

Nomor Profil isolat ESBL ^ ⅛ N O .& ⅛ S g S JS U U < ^ U H Φ < < ^	S OJ s O OJ S
Ps–33 (+) R I R R I R R R	R
Ps–55 (+) R R R R R N/A R N/A	R
L–66 (-) I S R S S N/A S I	R
U–157 (+) R R R R R S S N/A	R
U–166 (-) R R R R R R R R	R

Keterangan :

Ps = Pus; L = Lain - lain; U = Urine; S = Susceptible; I = Intermediet; R = Resistant; N/A = Not Available

2019

Il—∖/—∖ λ j Directoryof

OPEN ACCESS I_√ JOURNALS

Tabel 3. Hasil PCR dengan primer 16s RNA, blaSHV, blaTEM, dan blaCTX-M, blaFOX, blaKPC dan blaNDM-1 pada Isolat Klinis Multi-resistensi K. pneumoniae di Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah.

Nomor Isolat	16s RNA		ESBL		AmpC (blaFOX)	Karbapenemase
Nomor Isolat	16s RNA	blaSHV	blaTEM	blaCTX-M	AmpC (blaFOX)	blaKPC	blaNDM-1
Ps–33	(+)	-	-	(+)	-	-	-
Ps–55	(+)	-	-	(+)	-	-	-
L–66	(+)	(+)	(+)	-	-	-	-
U–157	(+)	(+)	(+)	-	-	-	-
U–166	(+)	-	-	-	-	-	-
Total	(5/5)	2/5	2/5	2/5	0/5	0/5	0/5

PEMBAHASAN

Hasil PCR terhadap 16s RNA menunjukan adanya pita dengan panjang basa 1,5 kilo bp pada semua sampel, sehingga disimpulkan bahwa semua sampel adalah isolat klinis K. pneumoniae. Empat dari lima sampel positif terhadap gen ESBL dengan uji genotip, namun terdapat satu sampel false negative pada uji fenotip, yakni sampel nomor L–66 dengan gen blaSHV dan blaTEM.

False negative ini juga ditemukan pada penelitian Tofteland dkk⁷ di Norwegia pada tahun 2003, dimana gen SHV-28 pada isolat K. pneumoniae memiliki aktivitas hidrolisis yang lemah terhadap cefpodoxime (MIC<0.75mg/liter) sehingga memiliki interpretasi negatif pada uji fenotip. Selain itu, sensitivitas uji Vitek sebesar

73%, jika dibandingkan dengan sensitivitas Disk Diffusion Test yang mencapai 96%.^11,12

Profil gen ESBL yang didapat dari hasil PCR menunjukan proporsi yang seimbang antara gen tunggal (blaCTX-M) dan gen multipel (blaSHV dan blaTEM). Hasil yang berbeda didapatkan dari penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Fatmawati dkk⁸ di RSUP Sanglah Denpasar tahun 2013 dan Goyal dkk¹³di India tahun 2009 yang menyatakan bahwa profil ESBL positif didominasi oleh jumlah gen multipel (co-existance). Perbedaan ini terjadi karena jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini sangat terbatas.

Studi yang dilakukan oleh Pitout dkk¹⁴ pada tahun 2005 menyatakan bahwa gen blaCTX-M pada E. coli bertanggungjawab terhadap kasus

2019

DOAJ

DIRECTORY OF OPEN ACCESS JOURNALS

infeksi yang didapat dari komunitas, sedangkan gen blaSHV dan blaTEM lebih

banyak ditemukan pada kasus - kasus HAIs.³ Sesuai dengan hasil studi tersebut, gen tunggal blaCTX-M yang didapat dari isolat pus diidentifikasi

dengan sumber penyebaran di komunitas, sedangkan gen blaSHV dan blaTEM yang didapat dari isolat lain -lain dan urin menyebar melalui infeksi di rumah sakit.

Secara genotip AmpC ditemukan negatif pada semua sampel meskipun secara fenotip terdapat resistensi terhadap sefalosporin generasi ketiga dan amoksisilin-asam klavulanat pada

Amerika Serikat tahun 2002 menyatakan bahwa enzim AmpC dapat

dikode oleh gen selain blaFOX seperti blaACC, blaCMY, blaMOX, blaDHA, blaCIT, dan blaEBM.

Begitu pula dengan kasus

resistensi terhadap karbapenem namun tidak ditemukan adanya gen blaKPC dan blaNDM-1 pada semua sampel penelitian. Hasil ini tidak bisa diklasifikasikan

sebagai false positif, walaupun uji fenotip yang digunakan tidak menggunakan Modified Hodge Test (MHT) sesuai dengan panduan standar internasional.¹² Banyak mekanisme lain yang dapat menyebabkan resistensi

Gambar 1. (a) Hasil PCR 16s RNA dengan panjang basa 1,5 kilo bp; (b) Hasil PCR gen blashv dengan panjang basa 862 bp; (c) Hasil PCR gen blactx-m dengan panjang basa 585 bp; (d) Hasil PCR gen blandm-1 negatif pada semua sampel. Kolom M menandakan penanda (marker) dari kit PCR, sedangkan kolom (-) merupakan kontrol negatif yang digunakan.

Penelitian yang dilakukan oleh Giakkoupi dkk¹⁵ di Yunani pada tahun 2003 menyatakan bahwa kelas

Metallo-β-Lactamase lainnya selain blaNDM, yakni blaVIM-1 positif pada K. pneumoniae dengan profil resistensi terhadap karbapenem. Selain itu, penelitian di Turki oleh Poirel dkk¹⁶tahun 2003 menemukan bahwa enzim karbapenemase pada K. pneumoniae juga dikode oleh gen kelas D, yaitu blaOXA-48.

Adanya enzim ESBL dan AmpC ditambah modifikasi atau delesi dari protein membran luar (Outer Membrane Protein K.

pneumoniae/OmpK) merupakan

mekanisme lain resistensi terhadap karbapenem.¹⁷ Mekanisme ini banyak diteliti oleh beberapa penelitian diantaranya oleh Wozniak dkk¹⁸ tahun 2011 di Chile yang menyatakan bahwa adanya gen ESBL pada hampir 90% sampel ditambah modifikasi atau delesi dari OmpK35 merupakan mekanisme resistensi terhadap karbapenem walaupun tidak ada gen karbapenemase yang dideteksi dengan PCR.

Penelitian yang dilakukan oleh Dahmen dkk¹⁹ di Tunisia pada tahun 2008 menggunakan isolat K. pneumoniae Kp16137 menyimpulkan

bahwa profil resistensi terhadap karbapenem didapat akibat gen multipel (co-existance) blaTEM, blaSHV, dan blaCMY ditambah delesi OmpK36.

Penelitian yang dilakukan oleh Chiu dkk²⁰ pada tahun 2012 di Taiwan juga menegaskan mekanisme utama resistensi terhadap karbapenem adalah adanya ko-eksistensi gen ESBL, AmpC, dan delesi OmpK35/36. Meskipun ditemukan adanya total prevalensi gen blaKPC, blaNDM dan blaVIM sebesar 22,3%, namun penyebab resistensi karbapenem diakibatkan karena ko-eksistensi gen ESBL/AmpC ditambah delesi OmpK35/36 masing– masing sebesar 90% dan 95%.

SIMPULAN

Sifat resistensi antibiotik golongan β-lactam, asam klavulanat dan sefalosporin dari uji fenotip pada penelitian ini kemungkinan disebabkan oleh adanya gen penyandi ESBL. Adapun resistensi terhadap karbapenem kemungkinan disebabkan oleh mekanisme resistensi lain, dan bukan akibat adanya gen penyandi karbapenemase.

Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui mekanisme resistensi terhadap karbapenem pada isolat klinis K. pneumoniae di RSUP

Sanglah, Denpasar. Penelitian yang melibatkan jumlah sampel yang lebih banyak dalam kurun waktu tertentu, mencakup gen karbapenemase di seluruh kelas (A, B, dan D), dan menganalisis profil dari protein membran OmpK.

UCAPAN TERIMA KASIH

Peneliti mengucapkan terimakasih banyak terhadap semua pihak yang membantu, terutama Laboratorium Mikrobiologi FK UNUD, Bagian/SMF Mikrobiologi FK UNUD/RSUP Sanglah, serta Instalasi Mikrobiologi Klinis RSUP Sanglah. Peneliti tidak memiliki konflik kepentingan apapun dalam penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

1. Center for Disease Control and Prevention (CDC). Antibiotic Resistance Threats in the United Status. CDC Publisher. 2013. Tersedia pada www.cdc.gov [diakses pada 10 Desember 2014]
2. World Health Organization (WHO). Antimicrobial Resistance Global Report on Surveillance. 2014. Tersedia pada

www.who.org [diakses pada 2 Desember 2014]

3. Pitout JD dkk. Emergence of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) in the community. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2005;56.
4. Kanj, Souha S dan Kanafani Zeina A. Current Concepts in Antimicrobial Therapy Against Resistant Gram – Negative Organism : Extended – Serum β – Lactamase Producing Enterobacteriaceae, Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae, and Multidrug – Resistant Pseudomonas Aeruginosa. Symposium on Antimicrobial

Therapy, Mayo Clinic Proceedings. 2011; 86 (3):250 – 259.

5. Nordmann, Patrice dkk. Global Spread of Carbapenamase – producing

Enterobacteriaceae. Journal of Emerging Infectious Disease. 2011; 17:1791 – 1798.

6. Weisburg, W. G., S. M. Barns, D. A. Pelletier, and D. J. Lane. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol.1991;173:697– 703.
7. Tofteland, Stale dkk. Effects of Phenotype and Genotype on Methods for Detection of Extended – Serum β – Lactamase Producing Clinical Isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Norway. Journal of Clinical Microbiology. 2007; 45(1):199-205.
8. Fatmawati, Dwi dkk. Molecular Characterization of Extended – Spectrum β-Lactamase-producing Klebsiella

pneumoniae isolated from clinical specimens at a tertiary-referral hospital in Denpasar, Bali, Indonesia. Journal of Advanced Science Letters. 2014.

9. Perez FJP, Hanson ND. Detection of Plasmid-Mediated AmpC Lactamase Genes in Clinical Isolates by Using Multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2002; 40 (6):2153 – 2162.
10. Solanki, Rachana dkk. Comparative Evaluation of Multiplex PCR and Routine Laboratory Phenotypic Methods for Detection of Carbapenemases among Gram Negative Bacilli. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2014; 8 (12):23 – 26.
11. Garrec, Helena dkk. Comparison of Nine Phenotypic Methods for Detection of Extended-Spectrum Lactamase Production by Enterobacteriaceae. Journal of Clinical Microbiology. 2011; 49 (3):1048-1057.
12. Control and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty – Second Informational Supplement. 2012; 32 (3). Tersedia pada www.clsi.org [diakses pada 20 Desember 2014]
13. Goyal A, dkk. Extended – Spectrum β-Lactamase in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae & Associated Risk Factors. Indian Journal of Medical Research. 2009; 129: 695-700.

2019

DOAJ

DIRECTORY OF OPEN ACCESS JOURNALS

14. Pitout JD, Laupland KB. Extended-

spectrum β-lactamase–producing

Enterobacteriaceae: an emerging public health concern. Lancet Infect Dis. 2008;8:159–66. doi:10.1016/S1473-

3099(08)70041-0.

15. Giakkoupi P, dkk. VIM-1 Metallo-β-

Lactamase-Producing Klebsiella pneumonia Strains in Greek Hospitals. Journal of Clinical Microbiology. 2003; 41 (8):3893-3896.

16. Poirel, Laurent dkk. Carbapenamases: Molecular Diversity and Clinical Consequences. Journal Future

Microbiology. 2007; 2 (5):501-512.

17. Pages, Jean – Marie dkk. The porin and the permeating antibiotic: a selective diffusion barrier in Gram-negative bacteria. Journal of Nature Reviews Microbiology. 2008; 6.
18. Wozniak, Aniela dkk. Porin alterations present in non carbapenemase producing Enterobacteriaceae with high and intermediate levels of carbapenem resistance in Chile. Journal of Medical Microbiology. 2012; 61:1270 – 1279.
19. Dahmen, Safia dkk. Imipenem Resistance in Klebsiella Pneumoniae is Associated to the Combination of Plasmid – Mediated CMY-4 AmpC β-Lactamase and Loss of an Outer Membrane Porin. Journal of Microbial Drug Resistance. 2012; 18 (5).
20. Chiu, Sheng-Kang dkk. National Surveillance Study on Carbapenem Non – Susceptible Klebsiella pneumoniae in Taiwan : The Emergence and Rapid Dissemination of KPC – 2 Carbapenamase. 2012. Tersedia pada www.plosone.org [diakses pada 21 Desember 2014]

https://ojs.unud.ac.id/index.php/eum

Studi Molekuler Gen Penyandi Enzim Extended Spectrum ?-Lactamase (ESBL), ?-Lactamase AmpC, dan Karbapenemase pada Isolat Klinis Multi-drug Resistant (MDR) Klebsiella pneumoniae di RSUP Sanglah, Denpasar

ABSTRAK

ABSTRACT

PENDAHULUAN

BAHAN DAN METODE

HASIL

PEMBAHASAN

DOAJ

SIMPULAN

UCAPAN TERIMA KASIH

DAFTAR PUSTAKA

DOAJ

Discussion and feedback