UJI TOKSISITAS EKSTRAK DAN ISOLAT DAUN SRIKAYA (Annona squamosa Linn) DAN IDENTIFIKASI SENYAWANYA
on
Cakra Kimia (Indonesian E-Journal of Applied Chemistry)
Volume 10 Nomor 2, Oktober 2022
UJI TOKSISITAS EKSTRAK DAN ISOLAT DAUN SRIKAYA (Annona squamosa Linn) DAN IDENTIFIKASI SENYAWANYA
Ni Luh Indra Dewi Senisk*, I Made Dira Swantara, Ida Ayu Raka Astiti Asih
Program Studi Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Udayana, Badung, Bali, Indonesia, 80361 *
ABSTRAK: Srikaya (Annona squamosa Linn) merupakan tanaman yang mengandung banyak manfaat yaitu pencegahan penyakit jantung, mencegah penyakit asma, mengatasi penyakit diabetes, mengobati masalah hipertensi mencegah dan mengobati penyakit kanker. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas toksik ekstrak dan isolat daun srikaya serta identifikasi kandungan senyawanya. Metode Brine Shrimp Mortality Test (BSLT) digunakan untuk uji toksisitas dan identifikasi senyawa dengan menggunakan instrumen LC MS/MS. Maserasi 750 g serbuk daun srikaya kering menggunakan pelarut metanol menghasilkan 64,45 g ekstrak kental. Uji toksisitas ekstrak kental metanol menunjukkan nilai LC50 sebesar 26,30 ppm. Partisi 45,0 g ekstrak kental metanol menghasilkan 14,3 g ekstrak n-heksana, 2,57 g kloroform dan 9,05 g n-butanol dengan nilai LC50 berturut-turut 104,71; 52,48; dan 323,59 ppm. Pemisahan senyawa pada ekstrak kloroform dilakukan dengan kromatografi kolom menghasilkan empat fraksi dengan fraksi A menunjukkan aktivitas paling toksik dengan nilai LC50 sebesar 100,00 ppm. Analisis LC MS/MS fraksi A menunjukkan adanya senyawa (6S,7αR)-6-hydroxy-4,4,7α-trimethyl-6,7-dihydro-5H-1-benzofuran-2-one (Loliolide); Cocamidopropyl betaine; Linolenic Acid; dan 1-Dodecyl-2-azepanon (Laurocapram).
Kata kunci: toksisitas, srikaya (Annona squamosa Linn), BSLT, Artemia salina Leach
ABSTRACT: Sugar apple (Annona squamosa Linn) has many benefits, i.e. preventing heart disease, preventing asthma, overcoming diabetes, treating hypertension problems, preventing and treating cancer. This research aims to find out the toxicity of sugar apple leaf extract and isolate and to identify their compounds. Brine Shrimp Mortality Test (BSLT) method was used for toxicity test and identification compounds carried out using the LC MS/MS instrument. Maceration of 750 g of dry sugar apple leaf powder using methanol as solvent yielded 64.45 g of thick extract. Toxicity test of methanol viscous extract showed an LC50 value of 26.30 ppm. Partition of 45.0 g of methanol thick extract produced 14.3 g of n-hexane extract, 2.57 g of chloroform and 9.05 g of n-butanol with LC50 values of 104.71; 52.48; and 323.59 ppm respectively. The separation of compounds in the chloroform extract was carried out by column chromatography resulting in four fractions with fraction A showing the highest toxicity with an LC50 value of 100.00 ppm. LC MS/MS analysis of fraction A showed the presence of compound (6S,7αR)-6-hydroxy-4,4,7α-trimethyl-6,7-dihydro-5H-1 -benzofuran-2-one (Loliolide) ;
Cocamidopropyl betaine; Linolenic Acid and 1-Dodecyl-2-azepanone (Laurocapram).
Keywords: toxicity, sugar apple (Annona squamosa Linn), BSLT, Artemia salina Leach
Penyakit kanker mempengaruhi kinerja pertumbuhan sel yang tidak normal [1].
dari organ dalam tubuh, penyebabnya adalah Hingga saat ini sudah banyak prosedur
pengobatan untuk penyakit kanker yang meliputi terapi medis dan non medis. Efektivitas dari pengobatan diatas masih kurang dan banyak efek samping yang ditimbulkan dari berbagai terapi yang dilakukan seperti rambut rontok, mual, muntah, gangguan tidur, lelah, gangguan pada mata, kemerahan pada kulit, penurunan atau peningkatan berat badan, sariawan, kesemutan dan konstipasi [2]. Banyaknya efek samping yang ditimbulkan tersebut mendorong munculnya penelitian-penelitian untuk mencari obat alternatif yang berasal dari alam yang dianggap memiliki efek samping lebih sedikit bahkan tidak memberi efek samping sama sekali. Obat alternatif dari bahan alam ini mengandung senyawa antikanker sehingga dapat menghambat pertumbuhan sel kanker pada tubuh. Senyawa yang berperan sebagai agen antikanker dapat ditemui pada banyak tanaman dan tumbuhan. Satu antara banyak bahan obat konvensional yang dipercaya di masyarakat sebagai obat antikanker yaitu srikaya (Annona squamosa Linn).
Srikaya merupakan tanaman yang mengandung banyak manfaat yaitu pencegahan penyakit jantung, mengatasi penyakit disentri akut dan diare, mencegah dan mengobati penyakit kanker, mencegah penyakit asma, mengatasi penyakit diabetes, mengobati masalah hipertensi, mengobati masalah kulit dan antiradang [3]. Kandungan metabolit sekunder pada daun srikaya antara lain karbohidarat, protein, saponin, tanin, polifenol, fitosterol, asam amino, terpenoid dan alkaloid [4].
Sebagai uji awal aktivitas antikanker suatu bahan digunakan uji toksisitas dengan metode BSLT. Metode ini merupakan metode yang singkat serta ekonomis untuk uji awal aktivitas toksik dari ekstrak tanaman dengan menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai bioindikator[5]. Adanya aktivitas biologi suatu bahan bisa diukur dengan
memperhitungkan jumlah kematian larva A. salina dampak dari pemberian senyawa pada konsentrasi tertentu. Hasilnya dikatakan toksik apabila bahan yang diuji menyebabkan 50% kematian pada konsentrasi kurang dari 1000 ppm (LC50 < 1000 ppm).
Berdasarkan latar belakang diatas, dilakukan studi lebih lanjut mengenai toksisitas ekstrak dan isolat daun srikaya dan identifikasi senyawanya.
Bahan yang digunakan meliputi daun srikaya, larva A. salina, metanol, air laut, akuades, n-heksana, kloroform, etil asetat, n-butanol, asam sulfat pekat, asam klorida 0,1 N, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, natrium hidroksida 10%, asam klorida pekat, serbuk Magnesium, pereaksi Liebermann-Burchard, asam sulfat 50% dan feri klorifa 1%.
Alat-alat yang digunakan berupa botol, corong, toples/botol kaca, blender, gunting, kertas saring,tabung reaksi, pipa kapiler, plat tetes, penangas air, botol vial, batang pengaduk, oven, silika gel 60, Beaker, pipet tetes, kolom kromatografi, lampu UV, bejana kromatografi, silika gel GF254, neraca, corong pisah, Rotary vacuum evaporator, dan instrumen analisis LC-MS/MS.
Daun srikaya yang dikumpulkan dibersihkan, dipotong lalu dikeringkan tanpa terkena cahaya matahari. Kemudian dihaluskan dengan blender hingga menjadi bubuk dan ditentukan kadar airnya.
Serbuk daun srikaya sebanyak 750 g dimaserasi dengan pelarut metanol. Hasil ekstrak yang sudah dimaserasi kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan rotary
vacuum evaporator kemudian mendapatkan hasil ekstrak kasar. Ekstrak kasar ini kemudian dilarutkan dalam campuran metanol-air dalam perbandingan 7:3 lalu diuapkan metanolnya dan diperoleh ekstrak air yang lalu dipartisi secara berurutan dengan n-heksana, kloroform dan n-butanol. Ekstrak yang diperoleh lalu dilakukan proses penguapan pada pelarutnya untuk kemudian diuji toksisitasnya.
Uji toksisitas dilakukan pada ekstrak, fraksi dan isolat yang diperoleh dengan menggunakan larva Artemia salina pada metode Meyer (1982). Penetasan larva dilakukan dengan menyiapkan akuarium yang tersekat dengan sekat berlubang menjadi dua bagian yaitu satu bagian yang dibuat gelap dan bagian lain dibiarkan terbuka kemudian diisi dengan air laut yang sudah di filter. Telur Artemia salina Leach dimasukkan ke wadah kaca atau akuarium pada bagian gelap. Akuarium kemudian diletakkan di tempat yang cukup terang selama 48 jam dan siap digunakan untuk pengujian. Disiapkan ekstrak yang akan diuji dengan konsentrasi 1000; 100 dan 10 μg/mL dalam air laut.
Larva A. salina sejumlah 10 ekor dimasukkan ke botol vial yang dicampur 100 μL air laut, ditambahkan larutan yang akan diuji sehingga memiliki konsentrasi masing-masing 10, 100, dan 1000 μg/mL. Larutan diaduk, dilakukan tiga kali pengulangan tiap konsentrasi dan kontrol dibuat tanpa menambahkan sampel, lalu diamkan selama satu hari atau 24 jam, lalu melakukan perhitung jumlah larva A. salina yang masih hidup dan yang mati. Pada perhitungan data analisa tersebut menggunakan metode persentase mortalitas larva A. salina pada masing-masing konsentrasi. Dibuat grafik antara log konsentrasi terhadap mortalitas. Nilai LC50 diperoleh dengan cara menarik garis pada nilai 50% dari sumbu mortalitas sampai
memotong sumbu grafik, titik potong antara garis yang ditarik ke garis konsentrasi dimana sampel/bahan menyebabkan kematian 50% larva disebut LC50 [6].
Ekstrak ditambahkan HCl 0,1 N. Pereaksi Meyer ditambahkan pada tabung pertama dan pereaksi Dragendorff ditambahkan pada tabung kedua masing-masing sebanyak 3 tetes. Terbentuknya endapan putih pada tabung pertama dan endapan jingga pada tabung kedua menunjukkan kandungan senyawa alkaloid.
Ekstrak ditambahkan beberapa tetes HCl pekat dan potongan kecil logam Mg. Perubahan warna menjadi jingga menunjukkan kandungan senyawa flavonoid.
Ekstrak ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard. perubahan warna menjadi ungu-merah-coklat menunjukkan kandungan senyawa triterpenoid dan perubahan warna menjadi warna hijau-biru menunjukkan kandungan senyawa steroid.
Ekstrak ditambahkan FeCl3 1%. perubahan warna menjadi ungu, biru atau hitam menunjukkan kandungan senyawa tanin.
Akuades ditambahkan pada ekstrak sampai seluruh sampel terendam, dididihkan selama beberapa menit, didinginkan, lalu dikocok dengan kuat. Timbulnya buih stabil menunjukkan kandungan senyawa saponin.
Ekstrak ditambahkan beberapa FeCl3. perubahan warna menjadi biru atau hitam menunjukkan adanya senyawa fenol.
Ekstrak hasil partisi yang paling toksik kemudian dikromatografi kolom dengan menggunakan campuran fase gerak n-heksana – kloroform (1:4). Eluat ditampung tiap 3 mL dalam botol vial dan dianalisis dengan KLT, eluat dengan pola noda yang sama digabungkan kemudian diuji toksisitasnya.
Fraksi hasil kromatografi kolom yang paling toksik terhadap larva A. salina diidentifikasi menggunakan LC-MS/MS ACQUITY UPLC Xevo G2-S QTof WATERS.
Sampel daun dicuci hingga bersih untuk menghilangkan residu dari tanah atau kotoran yang menempel dan dipotong untuk mempercepat proses pengeringan. Pengeringan bertujuan untuk mengurangi kandungan air dan meminimalisir tumbuhnya mikroba. Sampel dikeringkan tanpa terkena sinar matahari secara langsung agar metabolit sekunder yang terkandung pada sampel tidak rusak terutama senyawa dengan titik didih rendah atau senyawa yang mudah terdegradasi oleh sinar UV. Sampel kering lalu digiling dengan menggunakan blender sehingga berbentuk serbuk yang bertujuan untuk memperluas permukaan
sampel sehingga memperbesar kontak dengan pelarut.
Pengukuran kadar air dilakukan pada sampel daun srikaya yang telah dikeringkan. Prinsip dari pengukuran kadar air ialah menghilangkan air pada sampel dengan pemanasan pada suhu 105°C dalam jangka waktu tertentu. Kadar air sampel yang diperoleh pada penelitian ini sebesar 8,13 ± 0,1 %.
Hasil maserasi dari 750 g serbuk daun srikaya (Annona squamosa L.) didapatkan ekstrak kental metanol sebanyak 64,45 g yang berwarna hijau kehitaman dengan rendemen sebesar 8,59%. Ekstrak metanol sebanyak 45,0 g dipartisi berurutan dengan n-heksana, kloroform dan n-butanol diperoleh ekstrak berturut-turut sebesar 14,3 g; 2,57 g; 9,05 g.
Tabel 1 menunjukkan ekstrak metanol daun srikaya bersifat paling toksik. Ekstrak metanol dan n-heksana dikategorikan sebagai toksik tinggi/sangat toksik karena menunjukkan nilai LC50 lebih kecil dari 100 ppm sedangkan ekstrak n-heksana dan n-butanol dikategorikan sebagai toksik sedang karena menunjukkan nilai LC50 antara 100500 ppm.
Tabel 1. Hasil Uji Toksisitas Esktrak Daun Srikaya
|
Jenis Ekstrak |
Mortalitas ±SD (%) |
LC50 (ppm) | ||
|
10 ppm |
100 ppm |
1000 ppm | ||
|
metanol |
17,73 ± 7,51 |
92,09 ± 7,70 |
100 ± 0 |
26,30 |
|
n-heksana |
16,69 ± 3,40 |
48,38 ± 1,07 |
93,99 ± 0,21 |
104,71 |
|
kloroform |
19,58± 0,72 |
61,91± 4,13 |
94,64± 0,17 |
52,48 |
|
n-butanol |
3,34 ± 2,89 |
20,94 ± 3,70 |
3,34 ± 2,89 |
323,59 |
Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Kloroform Daun Srikaya
|
Uji Fitokimia |
Pereaksi |
Perubahan yang Timbul |
Hasil |
|
Alkaloid |
Dragendorff |
Tidak ada |
- |
|
Meyer |
Tidak ada |
- | |
|
Flavonoid |
Willstater |
Jingga |
+ |
|
Liebermann- |
Merah | ||
|
Steroid |
+ | ||
|
Burchard | |||
|
Liebermann- |
Biru kehitaman | ||
|
Triterpenoid |
Burchard |
+ | |
|
Tanin |
Akuades-FeCl3 |
Tidak ada |
- |
|
Fenol |
Metanol-FeCl3 |
Biru kehitaman |
+ |
|
Saponin |
Akuades-HCl |
Tidak ada |
- |
Skrining fitokimia yang dilakukan pada ekstrak kloroform antara lain uji alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, tannin dan fenol. Hasil skrining fitokimia ditunjukkan pada Tabel 2. Ekstrak kloroform daun srikaya mengandung senyawa flavonoid, steroid, teriterpenoid dan fenol.
Pemisahan ekstrak klorofom dengan kromatografi kolom dilakukan dengan menggunakan fase diam silica gel 60 dengan fase gerak campuran dari n-heksana:kloroform (1:4). Hasil pemisahan 1,5 g ekstrak kloroform menghasilkan 206 botol eluat yang ditampung tiap 3 mL dalam botol vial. Ekstrak yang masih terikat dalam silica gel dielusi menggunakan metanol dan eluatnya ditampung. Selanjutnya, masing-masing eluat yang diperoleh dilihat pola nodanya menggunakan kromatografi lapis tipis menggunakan eluen n-heksana : kloroform (1:4) untuk menggabungkan eluat
yang mempunyai pola noda sama. Eluat yang mempunyai pola noda sama memiliki senyawa yang hampir sama. Pola noda tersebut dideteksi dengan menggunakan lampu UV254 dan UV366.Berdasarkan pola noda masing-masing eluat, dihasilkan 4 fraksi seperti disajikan pada Tabel 3.
Fraksi dari hasil kolom kromatografi selanjutnya diuji toksisitasnya terhadap larva A. salina. Uji toksisitas masing-masing fraksi dilakukan untuk mengetahui fraksi yang paling toksik dan berpotensi sebagai antikanker yang akan dilanjutkan ke proses identifikasi. Hasil uji toksisitas keempat fraksi disajikan pada Tabel 4.
Fraksi dari hasil kolom kromatografi dikategorikan sebagai toksik sedang karena menunjukkan nilai LC50 antara 100-500 ppm. Hasil uji toksisitas menunjukkan ekstrak metanol memiliki nilai LC50 paling kecil yang menunjukkan ekstrak metanol bersifat paling toksik. Hal ini dapat disebabkan oleh senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol bekerja dalam sinergis.
Tabel 3. Hasil Kromatografi Kolom Ekstrak Kloroform Daun Srikaya
|
Fraksi |
Jumlah Nilai Rf Berat (g) noda |
|
A (1-25) B (26-100) C (101-145) D (146-206) |
3 3,1 ; 3,7 ; 4,1 0,0309 2 1,7 ; 2,4 0,0156 2 0,8 ; 1,4 0,0089 1 0,8 0,0289 |
Tabel 4. Hasil Uji Toksisitas Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
|
Fraksi |
Mortalitas ±SD (ppm) |
LC50 (ppm) | ||
|
10 ppm |
100 ppm |
1000 ppm | ||
|
A |
17,36 ± 1,20 |
50,16 ± 6,04 |
90,30 ± 3,58 |
100,00 |
|
B |
10,17 ± 0,30 |
36,90 ± 1,03 |
82,22 ± 3,85 |
204,17 |
|
C |
22,55 ± 4,24 |
59,53 ± 8,25 |
94,53 ± 0,36 |
316,22 |
|
D |
4,61 ± 0,12 |
20,47 ± 0,82 |
71,79 ± 4,43 |
407,38 |
Berdasarkan kromatogram pada Gambar 1 diperoleh 16 puncak namun hanya 4 puncak yang dapat dianalisis. Hasil analisis fraksi A daun srikaya dengan dugaan senyawanya dapat dilihat pada Tabel 5.
Berdasarkan kromatogram fraksi A pada Gambar 4.6, diperoleh 16 puncak namun hanya 4 puncak yang dapat dianalisis dan 12 puncak lainnya tidak dapat diidentifikasi lebih lanjut, karena tidak adanya kemiripan antara spektrum massa dengan database
ataupun tidak ada spektrum massa senyawa tersebut pada database.
Senyawa [(6S,7aR)-6-hydroxy-4,4,7a-
trimethyl-6,7-dihydro-5H-1-benzofuran-2-one atau Loliolide] diduga memiliki peran pada aktivitas antikanker fraksi A. Hal ini didukung dengan hasil penelitian yang mengatakan bahwa pada ekstrak metanol daun kecapi mempunyai aktivitas antikanker terhadap Murine cell leukemia P-388
dengan nilai IC50 sebesar 13,86 µg/mL dan dengan Loliolide sebagai senyawa yang
memiliki peran sebagai antikanker pada ekstrak ini [7].
MHS UNUD Bali
Nih Luh IDS kode Sample A
100
1: TOF MS ES+
BPI
5.90e6
16.85
Time
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00
Gambar 1. Kromatogram LC-MS/MS Fraksi A
|
Tabel 5. Hasil Analisis Spektra Massa dan Dugaan Senyawa Fraksi A | ||||
|
Waktu Retensi (Rt) (menit) |
Ion M+ (m/z) |
Rumus Molekul |
Dugaan Senyawa |
Golongan Senyawa |
|
5,851 |
197.1178 |
C11H16O3 |
• (6S,7αR)-6-hydroxy- 4,4,7α-trimethyl-6,7-dihydro-5H-1-benzofuran- 2-one atau Loliolide |
Monoterpenoid |
|
9,894 |
343.2959 |
C19H38N2O3 |
• Cocamidopropyl betaine |
Amina |
|
13,213 |
279.2314 |
C18H30O2 |
• Linolenic acid |
Asam Lemak |
|
15,448 |
282.2814 |
C18H35NO |
• 1-Dodecyl-2-azepanon atau Laurocapram |
Alkaloid |
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, dapat disimpulkan fraksi A dari hasil kromatografi kolom ekstrak kloroform daun srikaya bersifat paling toksik dengan nilai LC50 sebesar 100,0 ppm. Hasil
identifikasi instrument LC-MS/MS
menunjukkan fraksi A mengandung senyawa (6S,7aR)-6-hydroxy-4,4,7a-
trimethyl-6,7-dihydro-5H-1-benzofuran-2-one (Loliolide); Cocamidopropyl betaine; Linolenic Acid; dan 1-Dodecyl-2-azepanon (Laurocapram). Senyawa Loliolide yang merupakan golongan senyawa
monoterpenoid diduga berperan sebagai antikanker.
Penulis mengungkapkan terimakasih kepada semua pihak yang telah ikut serta mendukung penulis dalam proses menyelesaikan penelitian ini.
-
[1] Akmal M, Zely I, Widhawati, Sekar S.
2010. Ensiklopedi Kesehatan Untuk Umum. Ar-Ruzz Media. Yogyakarta.
-
[2] Love, R.R., Leventhal, H., Esaterling, D.V., dan Nerenz, D.R. 1989. Side Effects and Emotional During Cancer
Chemoteraphy. Jurnal Cancer 63(3): 12-604.
-
[3] Nurjanah, N., dan Ihsan, N., 2013, Ancaman dibalik Segarnya Buah dan Sayur, Pustaka Bunda. Jakarta..
-
[4] Tansil, Sukmawati, Mahmud
Ghaznawie dan Gabriela Reginata. 2016. Deteksi Dini Karsinoma Sel Basal. Indonesian Journal of Cancer. 10 (2) : 61-66.
-
[5] Meyer, Laughlin, Ferrigini. 1982. “Brine Shrimp: Convenient General Bioassay for Active Constituent”. Planta Medica 45: 31 – 34.
-
[6] Colegate, S. M. and Molyneux, R. J. 1993. Bioactive Natural Products Detection : Isolation and Structural Determination. CRC Press, Inc. Boca Raton Florida. pp : 444-454.
-
[7] Susanti, F.E., P. Sugita., And L. Ambasari. 2016. Purification OfActive Compounds From Kecapi Leaves That Have Potential As Anticancer For In Vitro On Murine Cells Leukemia P388. Int. J. Chem. Sci. 14(3): 13761384.
104
Discussion and feedback