JURNAL SIMBIOSIS II (2): 173- 183

Jurusan Biologi FMIPA Universitas Udayana

ISSN: 2337-7224

September 2014

KERUSAKANKROMOSOM BAWANG MERAH (Allium cepaL.) AKIBAT PERENDAMAN DENGAN ETIDIUM BROMIDA

CHROMOSOMESDAMAGEOF ONION(Allium cepa L.)AFTER SUBMERSION IN ETHIDIUM BROMIDE

Eka Fibayani Imaniar, Made Pharmawati

Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana, Kampus Bukit Jimbaran email: [email protected]

INTISARI

Penelitian ini bertujuan melihat kerusakan kromosom bawang merah(Allium cepa L.) yang ditimbulkan oleh etidium bromida pada perendaman 6 dan 12 jam dengan konsentrasi 500 ppm. Metode penelitian yang digunakan untuk melihat kerusakan kromosom adalah teknik squash pada ujung akar bawang merah. Pada hasil penelitian ditemukan beberapa jenis kerusakan kromosom bawang merah setelah perendaman dengan etidium bromida, antara lain kromosom tampak terpotong-potong,terbentuk mikronuklei, ‘tunas’ nukleus dan jembatan kromosom. Pada perendaman 6 jam didapat persentase kerusakan kromosom rata-rata sebesar 2,99%, sedangkan pada perendaman selama 12 jam didapat persentase kerusakan kromosom rata-rata sebesar 6,81%.

Kata kunci : Etidium bromida, kerusakan kromosom, Allium cepa L.

ABSTRACT

The aim of this research was to identify thedamage of onion’s(AlliumcepaL.) chromosomes causedbyethidiumbromide submersion for 6and12hoursat 500ppm. The methodused to study chromosome damage of onionroot tip wassquash technique. The result showed several types of chromosomedamagesuch as the formation of, micronuclei, nuclear buds and chromosome bridges. At 6 hours submersion,the average percentageof chromosomal damage was 2.99 %, while in submersion for 12 hours, the average percentage of chromosomal damage was 6.81 %.

Keywords:Ethidium bromide, chromosome damage, Allium cepa L.

PENDAHULUAN

Etidium bromida merupakan senyawa yang digunakan untuk analisis DNAyaitu untuk memvisualisasi potongan-potongan DNA pada gel elektroforesis. Etidium bromida merupakan molekul yang mengikat kuat pada DNA yang dikenal dengan agen interkelat karena mengkelat pada susunan DNA yang kokoh.Oleh

sebab itu, etidium bromidadapat merusak pilin ganda dan menghambat replikasi DNA, transkripsi, perbaikan DNA, rekombinasidan menyebabkan aberasi kromosom (Reha et al., 2003).Aberasi kromosom adalah perubahan jumlah kromosom dan susunan atau urutan gen dalam kromosom yang terjadi akibat faktor

fisika, kimia dan biologi sehingga mengakibatkan abnormalitas pada individu (Edwards, 2005).Perubahan materi genetik yang diakibatkan oleh mutagen kimia dapat diamati secara sitologi dari proses mitosis yang tejadi pada sel-sel yang sedang aktif tumbuh (ujung akar dan ujung batang). Jenis aberasi kromosom yang terjadi tergantung pada tahap siklus sel saat terkena mutagen kimia dan jenis mutagen kimia yang menginduksi kromosom (Hall, 2000).

Etidium bromida bersifat karsinogenik dan mutagenik dalam konsentrasi tertentu.Ditemukan penurunan berat bersih sebesar 50% pada kultur jaringan ‘Indiangrass’ setelah perlakuan 250 mgL-1 etidium bromida selama 24 jam (Stephens, 2009).Hasil penelitianpada bakteri Salmonella menunjukkan bahwa etidium bromida adalah mutagen yang menyebabkan gangguan pada metabolismebakteri tersebut (MacCannet al., 1975).Telur landak laut yang terkena 50 µM atau lebih etidium bromida memiliki kelainan kromosom dan mengalami kegagalan pembelahan sel (Vacquier and Brachet, 1969).

Kemampuan etidium bromida untuk berinterkalasi memiliki potensi berbahaya bagi makhluk hidup.Pengujian kerusakan kromosom yang disebabkan oleh etidium bromida pada tingkat molekuler yaitu

tingkat kromosomtumbuhan perlu dilakukan.Bawang merah dapat dijadikan sebagai model untuk studi mekanisme mutagenesis pada kromosom yang diinduksi oleh bahan kimia seperti etidium bromida. Jumlah kromosom yang tidak terlalu banyak yaitu 2n=16 (Sastrosumarjodkk., 2006) serta fase mitosis yang jelas terlihat menjadikan bawang merah ideal digunakan dalam mempelajari kerusakan kromosom pada tanaman, selain itu kromosom bawang merah memiliki ukuran yang besar dan cukup mudah untuk dibuat preparatnya (Sastrosumarjo, 2006).

Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi kerusakan kromosom yang diakibatkan oleh etidium bromida pada perendaman 6 dan 12 jam dengan konsentrasi 500 ppm yang dilihat pada saat fase mitosis pada akar bawang merah. Pengamatan kromosom dilakukan dengan teknik squash pada ujung akar bawang merah.

MATERI DAN METODE

Pembuatan Larutan Etidium Bromida

Konsentrasi larutan etidium bromida yang digunakan sebagai perlakuan untuk perendaman akar bawang merah adalah 500ppm.Larutan etidium bromida dibuat dengan melarutkan etidium bromida sebanyak 15 mg dalam 30 ml aquades.

Pengakaran Bawang Merah dan Perendaman dengan Etidium Bromida

Induksi akar bawang merah dilakukan dengan cara merendam bagian bawah umbi bawang merah dalam air pada gelas plastik. Perendaman dalam air dilakukan selama 7 hari atau hingga panjang akar 45cm.

Akar bawang merah yang telah tumbuh 4-5cm direndam pada larutan etidium bromida.Akar yang direndam adalah bagian ujung akar hingga mencapai ¾ bagian akar (tidak sampai menyentuh bagian pangkal umbi bawang merah). Akar direndam selama 6 jam dan 12 jam.

Pengamatan Kromosom

Ujung akar bawang merah yang telah direndam dalamlarutan etidium bromida dipotong pada pukul 07.00-08.30 dan pukul 09.00-10.00 sepanjang 1-2 cm. Akar yang telah dipotong dimasukkan ke dalam lima tabung Eppendorf yang telah diisi larutan fiksatif farmer’s (Etanol absolut:asam asetat glasial (3:1)), masing-masing tabung berisi 2 akar yang berasal dari satu umbi.

Preparat akar bawang merah dibuat dengan metode squash.Setelah ujung akar difiksasi dengan larutan fiksatif selama 124 jam pada suhu -20o C, akar dicuci dengan aquades dan dihidrolisa dengan HCL 2N pada suhu 60oC selama 2-3

menit. Setelah dihidrolisa, akar dibilas dengan aquades kemudian diletakkan diatas gelas benda dan dipotong 1-2mm, ditetesi pewarna acetoorcein 2% sebanyak satu tetes, dibiarkan selama 30 menit-1 jam, preparat ditutup dengan cover glass dan ditekan dengan kertas saring sambil diisap sisa pewarna yang tercecer disekitar kaca penutup. Selanjutnya preparat dipanaskan diatas api bunsen selama 1 menit agar pewarna meresap dengan sempurna. Preparat diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x40.

Analisis Data

Dihitung jumlah sel yang mengalami kerusakan kromosom pada fase tertentu saat mitosis serta jumlah semua sel pada preparat, kemudian ditentukan persentase kerusakan kromosom yang terjadi akibat perendaman etidium bromida. Berikut rumus yang digunakan untuk menghitung persentase kromosom yang rusak :

Persentase kromosom yang rusak =

∑ sel yang mengalami kerusakan ∑ sel yang diamai

X 100%


HASIL

Hasil menunjukkan bahwa mitosis dapat diamati pada pemotongan pukul 07.30-09.00.Persentase sel yang mengalami kerusakan dan tipe kerusakan

kromosom akibat perendaman etidium bromida dapat dilihat pada Tabel 1.Persentase rata-rata kerusakan kromosom pada perendaman dengan etidium bromida selama 6 jam yang diamati pada 7 akar

adalah 2,99%. Pada perendaman selama 12 jam yangdiamati pada 6 akar, didapat persentase rata-rata sebesar 6,81%. Kerusakan yang terjadi ditampilkan pada Gambar 1.

Tabel 1. Persentase kerusakan kromosom akibat perendaman etidium bromida

Lama Perendaman

Rasio sel dengan kromosom abnormalper total sel yang diamati

Persentase sel yang mengalami kerusakan kromosom

Rata-rata persentase sel dengan kerusakan kromosom

6 jam

Akar 1

3/161

1,86%

Akar 2

1/84

1,19%

Akar 3

2/78

2,56%

Akar 4

4/80

5%

2,99%

Akar 5

2/39

5,13%

Akar 6

3/120

2,5%

Akar 7

2/75

2,67%

12 jam

Akar 1

10/64

15,63%

Akar 2

9/114

7,89%

Akar 3

3/26

11,54%

6,81%

Akar 4

1/52

1,92%

Akar 5

1/71

1,41%

Akar 6

2/81

2,47%

Keterangan : Perbesaran 400x



Gambar 1.Jenis kerusakan kromosom akibat perendaman etidium bromida selama 6 dan 12 jam: a)kromosom tampak terpotong-potong(terfragmentasi), b) jembatan kromosom pada anafase,c) 2 mikronuklei, d) inti sel membentuk tunas (nuclear bud), e) kromosom tampak menyatu, f) kromosom berada pada satu bidang dan di sebelah sisinya terdapat kromosom yang bergerombol


PEMBAHASAN

Pemotongan akar bawang untuk membuat pengamatan kromosomdilakukan pada waktu-waktu tertentu agar dapat ditemukan fase mitosis bawang merah.Pada penelitian ini kromosom dapat terlihat jelas pada pemotongan akar pukul 07.30-09.00.Kromosom teramati pada fase profase, metafase dan anafase.Perendaman akar dengan etidium bromida selama 6 dan 12 jam menyebabkan terjadinya kerusakan kromosom yaitu kromosom tampak terpotong-potong, terbentuk mikronuklei, ‘tunas’ nukleus dan jembatan kromosom.

Kerusakan kromosom berupa fragmentasi kromosom atau kromsom tampak terpotong-potong ditemukan pada penelitian Amer and Ali(1969) yang menggunakan pentachloropenol (sejenis pestisida) pada Vicia faba.Larutan pestisida lain yang dilaporkan menyebabkan fragmentasi kromosomantara lain ferbampadaAllium cepa(Prassad and Pramer, 1968), linuron pada Hordeum sp.(Wuu and Granat, 1966), dan simazin pada Vicia cracca(Tomkins and Granat, 1976). Patahan kromosom (fragmentasi) dapat terjadi akibat putusnya lengan kromosom pada tempat tertentu.Kromosom yang putus dapat tersambung kembali dengan bagian potongan kromosom asalnya atau

dengan potongan kromosom lain (Suryo, 1995).

Alel mutan pada jagungdilaporkan menyebabkan terjadinya distribusi jumlah kromosom yang tidak merata menuju kutub, hal ini disebabkan oleh distribusi abnormal dari mikrotubuli (Liu andInna, 1993).Aberasi kromosom berupa sticky, C-metafase, laggard dan binukleat ditemukan pada sel meristematis akar Vigna mungo akibat pemaparan kromium (Chidambaram et al., 2009). Jembatan kromosom dapat terjadi karena inversi parasentrik yang terjadi saat pindah silang sehingga pada bagian inversiakan menghasilkan kromosom dengan sentromer yang membentuk jembatan dengan sentromer lain. Multipolar anafase terjadi karena kromosom bergerak bersamaan pada empat kutub berlawanan yang disebabkan oleh tarikan benang spindel (Xiao-wei, 2004).

Terbentuknya mikronuklei merupakan kejadian yang sering terjadi pada kerusakan kromosom. Azlia dan Wardini (2010) melaporkan terjadi aberasi kromosom dan mikronuklei di sel ujung akar Allium cepa yang disebabkan oleh air lindi (air limbah yang diproduksi oleh tempat pembuangan akhir sampah). Aberasi kromosom dan mikronuklei juga ditemukan pada tanaman lainnya seperti

Crepiscapillaris(Grant and Owens, 1998) danHordeumvulgare(Gecheff, 1996).Mikronuklei adalah struktur menyerupai nukleus yang berukuran lebih kecil dari nukleus.Mikronuklei terjadi akibat kegagalan pembagian kromosom pada saat mitosis sel yaitu pada anafase. Kegagalan pembagian kromosom ini akan meninggalkan sebuah struktur menyerupai nukleus dan ukuran lebih kecil (Lusiyantidkk., 1996).

Mutagen kimia dapat menyebabkan aberasi kromosom yang terjadi dengan beberapa cara. Pertama, mutagen kimia secara langsung mempengaruhi DNA dan menimbulkan aberasi kromosom. Kedua, mutagen kimia dapat mengganggu sintesis DNA dan protein sehingga menyebabkan terbentuk pergerakan kromosom abnormal yang menyebabkan aberasi kromoosm.Ketiga, kandungan dalam mutagen kimia dapat mencegah perbaikan kromosom yang tidak normal (Xiao-wei, 2004).

Etidium bromida dapat menginterkalasi asam nukleat sehingga umum digunakan dalam bidang biologi molekuler. Molekul etidium mengkelat pada susunan DNA yang kokoh sehingga dapat merusak struktur double helix dan menghambat replikasi DNA, transkripsi, perbaikan DNA, dan rekombinasi (Reha et al., 2003). Berdasarkan analisis waktu

yang dihabiskan untuk pra kopulasi dan kopulasi, etidium bromida memiliki efek negatif dalam semua tahap perkembangan telur, larva, pupa, dan dewasa dari sepuluh generasi Drosophila melanogaster yang terkena perlakuan30 µM etidium bromida selama 15 hari. Hasilnya menunjukkan bahwa etidium bromida mengganggu kelangsungan hidup telur,larva, pupa, dan dewasa Drosophila melanogaster. Data yang didapat menunjukkan bahwa etidium bromida memiliki pengaruh dalam perkembangan gen yang menyebabkan beberapa individu menjadi tidak viabel untuk mencapai fase dewasa (Ouchiet al., 2007). Telur landak laut yang terpapar 50uM larutan etidium bromida mengalami perkembangan kromosom yang abnormal dan kegagalan kromosom untuk membelah (Vacquier and Brachet 1969).

Kerusakan kromosom pada akar bawang merah (Allium cepa L.) akibat perendaman dalam etidium bromida ini menunjukkan bahwa etidium bromida tidak hanya memiliki efek negatif pada hewan dan bakteri, tetapi juga pada tumbuhan.

SIMPULAN

Terjadi kerusakan kromosom karena perendaman akar bawang merah dengan etidium bromida.Kerusakan yang terjadi yaitu kromosom tampak terpotong-potong,

terbentuk mikronuklei, ‘tunas’ nukleus dan jembatan kromosom.Persentase kerusakan pada perendaman 12 jam lebih besar yaitu 6,81% dibanding perendaman 6 jam yaitu 2,99%.

KEPUSTAKAAN

Amer, S.M., E.M. Ali. 1969. Cytological Effects of Pesticides. IV. Mitotic Effects of Some Phenols. Cytologia. 34:1

Azlia, N., T.H. Wardini. 2010. Toksisitas Air Lindi TPAS (Tempat Pembuangan Akhir Sampah) Sarimukti pada Umbi Bawang Merah (Allium cepa L.) Program Studi Sarjana Biologi SITH. (Skripsi) Tidak dipublikasikan

Chidambaram, A., P. Sundaramoorthy, A. Murugan, K.S. Ganesh, L. Baskaran. 2009. Chromium induced cytotoxicity in blackgram (Vigna mungo L.). Iran. J. Environ. Health Sci. Eng. 6: 17-22

Edwards, A.A. 2005. The use of chromosomal aberrations in human lymphocytes for biological dosimetri, Radiation research.148: 539-544

Gecheff K.I. 1996. Production and Identification of New Structural Chromosome Mutations in Barley (Hordeum vulgare L.)Theor. Appl. Genet. 92: 81-777

Grant, W.F., E.T. Owens. 1998. Chromosome Aberration Assays in Crepis for the Study of Environmental Mutagens. Mutat. Res. 410: 291-307

Hall, E. J. 2000. Radiobiology for the Radiobiologist 5th Edition. JB Lippincott Company Philadelphia

Liu, Q., G. Inna. 1993. Abnormal Cytoskeletal and Chromosome Distribution in PO, ms4 and ms6; Mutant Alleles of Polymitotic that Disrupt the Cell Cycle Progression from Meiosis to Mitosis in Maize. J.of Cell Sci. 106-1169

Lusiyanti, Y., I. Iwiq, W. Abdul.1996. Studi Awal Mikronuklei Pada Sel Limfosit Perifer Massnelly. PSPKDR.Batan. 1-4

MacCann, J., E. Choi, E.Yamasaki, B.N. Ames. 1975. Detection of Carcinogens as Mutagens in the Salmonella/Microsome Test:Assay of 300 Chemicals. Proc. Natl. Acad. Sci. 72:5135–5139

Ouchi , R. Y., A. J. Manzato, C. R. Ceron, G.O. Bonilla-Rodriguez. 2007. Evaluation of the Effects of a Single Exposure to Ethidium Bromide in Drosophila melanogaster            (Diptera-

Drosophilidae). Bull. Env. Cont. Tox. 1-3

Prassad, I., D. Pramer. 1968. Genetics Effects of Ferbam on Aspergillus niger         and        Allium

cepa.Phytopathology 58:1188

Reha, D., M.Kabelác, F. Ryjácek, J. Sponer, J.E. Sponer, M. lstner, S. Suhai, P. Hobza. 2003. Intercalators Nature of stacking interactions between intercalators (etidium, daunomycin, ellipticine, and 4',6-diaminide-2-phenylindole) and DNA base pairs. Ab initio quantum chemical, density functional theory, and empirical potential study.J. American Chem. Soc. 124: 66-76

Sastrosumarjo, S. 2006. Sitogenetika Tanaman. IPB Press. Bogor

Sastrosumarjo, S., S.I. Yudiwanti, S. Aisyah, M. Sujiprihati, R. Syukur, Yunianti. 2006. Panduan Laboratorium          Sitogenetika

Tanaman. IPB Press. Bogor

Stephens, L.C. 2009. Etidium Bromida-induced Mutations from Inflorescence Cultures of Indiangrass.Hort.   Sci. 44:1215

1217

Suryo, 1995.Sitogenetika.Gadjah Mada University Press. Yogyakarta

Tomkins, D.J., W.F. Granat. Monitoring Natural Vegetation for Herbicide Induced Chromosomal Aberration. Mutat. Res. 36:73

Vacquier V.D., J. Brachet. 1969. Chromosomal Abnormalities Resulting from Ethidium Bromida Treatment. Natural. 222:193–195

Wuu, K.D., W.F. Granat. 1966. Morphological and Somatic Chromosomal Aberations Induced by Pesticides in Barley (Hordeum vulgare). Can. J. Genet.Cytol. 8:481

Xiao-wei, K. 2004. Mutagenic Effects of Chromium Trioxide on Root Tip Cells of Vicia faba. J. Zhejiang University Sci. 5, 12: 1570-1576