UJI KEMURNIAN ISOLAT ANDROGRAFOLID DENGAN HPLC FASE TERBALIK
on
JURNAL FARMASI UDAY AN A
o , 23 , -7716
Vol. 5 No 2 TahunlOlfi
UJI KEMURNIAN ISOLAT ANDROGRAFOLID DENGAN HPLC FASE TERBALIK
Wirasuta, I.M.A.G. 1), Astuti, N.M.W. 1), Dharmapradnyawati, N.N.P. 1), Wiputri, N.M.C.A. 1) Warditiani N.K. 1), Indriani, N. P. W. 1), Widjaja, I.N.K. 1), 1Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana
Korespondensi:
Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana Jalan Kampus Unud-Jimbaran, Jimbaran-Bali, Indonesia 80364 Telp./Fax. 703837 Email: [email protected]
Abstrak
Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees) telah dimanfaatkan secara tradisional sebagai obat. Andrografolid yang diisolasi dari herba sambiloto memiliki beberapa aktivitas farmakologi. Standarisasi isolat andrografolid penting dilakukan untuk kontrol kualitas. Profil sidik jari sebagai standar utama dari bahan baku obat herbal atau produk herbal menunjukkan kandungan kimia yang utuh dari bahan baku obat herbal maupun produk herbal. Dengan demikian, uji kemurnian isolat andrografolid perlu dilakukan bertujuan untuk mengetahui profil sidik jari isolat andrografolid sehingga dapat dijadikan kontrol kualitas terhadap isolat andrografolid. Metode HPLC dengan kolom Luna 5u C18 (150 x 4,6 mm i.d, 5μm) dan detektor diode array (DAD) dimanfaatkan memperoleh profil sidik jari sebagai identitas isolat andrografolid.
Pemisahan isolat andrografolid dengan sistem HPLC fase gerak asetonitril 28% dalam air dan fase gerak campuran asetonitril 15% dan metanol-air (60:40) 85% memberikan masing-masing enam puncak kromatogram. Berdasarkan parameter kromatogram, uji kemurnian isolat andrografolid untuk profil sidik jari memberikan hasil yang terbaik pada panjang gelombang 230 nm dengan sistem kromatografi menggunakan fase gerak asetonitril 28% dalam air. Sistem ini sangat baik digunakan untuk uji deteksi sidik jari kandungan andrografolid dalam isolat.
Kata Kunci: Isolat Andrografolid, Standarisasi, Profil Sidik Jari, HPLC.
Kristalisasi andrografolid dari ekstrak metanol panas dilakukan dengan menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat. Uji kemurnian kristal yang diperoleh dengan menggunakan sistem Farmakope Indonesia diperoleh satu noda dengan in-situ UV spektra dan Rf sesuai dengan standar pembanding [Warditiani, 2014]. Metode esktraksi berpengaruh pada konstituen senyawa penyusunnya dan kandungan andrografolid [Laksmiani, 2015]. Uji kemurnian sebaiknya dilakukan dengan lebih dari satu metode.
HPLC telah digunakan untuk mengidentifikasi turunan andrografolid hasil isolasi daun sambiloto. Pemisahan menggunakan kolom reverse phase dengan elusi secara isokratik dengan fase gerak terdiri dari 28% asetonitril dalam air dengan laju alir 1,2 mL/menit, diperoleh turunan andrografolid 14-deoksi-11,12-didehidroandrografolid,
neoandrografolid, dan 14-deoksiandrografolid [Pholphana et al., 2013]. Pemisahan senyawa turunan andrografolid tersebut dari penelitian Kumar et al. (2014) menggunakan elusi secara isokratik pada kolom RP-C18 dengan campuran fase gerak asetonitril (15% pelarut A) dan metanol – air, 60 : 40 (85% pelarut B). Profil kromatogram HPLC dapat digunakan sebagai sidik jari kromatografi isolat andrografolid, yang mana sidikjari ini dapat digunakan dalam kontrol kualitas hasil kristalisasi. Pada penelitian ini dilaporkan identifikasi kemurnian isolat hasil kristalisasi andrografolid dengan metode yang dikembangkan oleh [Warditiani, 2014] menggunakan metode HPLC fase balik dengan kolom RP-C18.
Isolat andrografolid dari herba sambiloto (Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees) yang diperoleh di Laboratorium Biologi Farmasi, Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana. Pelarut yang digunakan dalam HPLC yakni: metanol, asetonitril, dan Water for Injection (WFI). Alat yang digunakan yakni seperangkat instrumen HPLC dengan menggunakan kolom Luna 5u C18 (150 x 4,6 mm i.d, 5μm) dan detektor diode array (DAD).
-
2.2.1 KLT Preparatif Isolat Andrografolid
Plat kaca KLT Si G60F254 berukuran 5 x 10 cm yang telah dicuci dan diaktivasi ditotolkan isolat dengan konsentrasi 25 µg/mL, berbentuk pita sebanyak 70µL. Plat dielusi dengan campuran kloroform dan air dengan perbandingan 9 : 1 (v/v) dan dikeringkan pada oven 60 oC selama 5 menit. Plat kemudian dipindai dengan panjang gelombang 230 nm
pada empat bagian, puncak andrografolid dibaca spektrumnya pada rentang 200-600 nm.
-
2.2.2 Analisis Komponen dalam Isolat
Andrografolid dari Herba Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm. F.) Nees)
Analisis andrografolid dan derivat dalam sampel menggunakan dua sistem fase gerak diantaranya (1) asetonitril 28% dalam air; dan (2) asetonitril 15% dan metanol-air (60:40) 85% v/v, dengan laju alir 1,2 mL/menit. Temperatur kolom diatur pada suhu 25oC dan deteksi menggunakan detektor diode array pada panjang gelombang deteksi terpilih. Diulang injeksi sebanyak 3 kali. Dicatat spektrum dan dibandingkan waktu retensi (tR) dengan pustaka acuan.
Gambar 1. Densitogram KLT Preparatif dan in-situ Spektrum Andrografolid. Densitogram menggambarkan satu puncak dengan Rf 0,38.
Gambar 2. Kromatogram Pemisahan Isolat dan Standar dengan Fase Gerak Asetonitril 28% dalam Air pada Deteksi pada Panjang Gelombang 210, 223, dan 230 nm serta Spektrum masing-masing Puncak
Gambar 3. Kromatogram pemisahan isolat dan standar dengan fase gerak campuran asetonitril 15% dan metanol-air (60:40) 85% pada deteksi pada panjang gelombang 210, 223, dan 230 nm serta spektrum masing-masing puncak
Tabel 1 Parameter kromatografi metode pemisahan dengan fase gerak asetonitril 28% dalam air
|
No . |
Panjang gelombang deteksi (nm) |
Rt (menit) |
Tailing factor |
Α |
Resolusi | ||
|
dengan puncak sebelumnya |
dengan puncak setelahnya |
dengan puncak sebelumnya |
dengan puncak setelahnya | ||||
|
1 |
0.835 |
2.09 |
- |
2.99 |
- |
1.92 | |
|
2 |
1.248 |
1.02 |
2.99 |
1.41 |
1.92 |
0.8 | |
|
3 |
210 |
1.504 |
1.43 |
1.41 |
1.56 |
0.8 |
1.5 |
|
4 |
1.993 |
1.27 |
1.56 |
8.71 |
1.5 |
10.38 | |
|
5 |
12.53 |
3.25 |
8.71 |
1.23 |
10.38 |
2.33 | |
|
6 |
15.313 |
0.64 |
1.23 |
- |
2.33 |
- | |
|
1 |
0.832 |
1.6 |
- |
5.92 |
- |
2.74 | |
|
2 |
1.250 |
0.98 |
5.92 |
1.51 |
2.74 |
1.03 | |
|
3 |
223 |
1.505 |
0.94 |
1.51 |
1.64 |
1.03 |
2.09 |
|
4 |
1.992 |
0.97 |
1.64 |
9.47 |
2.09 |
24.82 | |
|
5 |
12.539 |
1.27 |
9.47 |
1.24 |
24.82 |
5.56 | |
|
6 |
15.302 |
0.95 |
1.24 |
- |
5.56 |
- | |
|
1 |
0.831 |
1.25 |
- |
1.51 |
- |
1.29 | |
|
2 |
1.251 |
0.67 |
1.51 |
1.2 |
1.29 |
0.75 | |
|
3 |
230 |
1.506 |
0.94 |
1.2 |
1.32 |
0.75 |
1.95 |
|
4 |
1.992 |
1.15 |
1.32 |
6.29 |
1.95 |
40.18 | |
|
5 |
12.539 |
1.65 |
6.29 |
1.23 |
40.18 |
5.12 | |
|
6 |
15.299 |
0.69 |
1.23 |
- |
5.12 |
- | |
Tabel 2 Parameter kromatografi metode pemisahan dengan fase gerak asetonitril 15% dan metanol-air (60:40) 85% v/v
|
No. |
Panjang gelombang deteksi (nm) |
Rt (menit) |
Tailing factor |
Α |
Resolusi | ||
|
dengan puncak sebelumnya |
dengan puncak setelahnya |
dengan puncak sebelumnya |
dengan puncak setelahnya | ||||
|
1 |
0.826 |
1.57 |
- |
11.41 |
- |
1.57 | |
|
2 |
1.305 |
0.74 |
11.41 |
1.34 |
1.57 |
0.66 | |
|
3 |
210 |
1.483 |
1.51 |
1.34 |
1.35 |
0.66 |
1.31 |
|
4 |
1.732 |
1.05 |
1.35 |
1.14 |
1.31 |
0.86 | |
|
5 |
2.901 |
0.95 |
1.14 |
1.12 |
0.86 |
1.02 | |
|
6 |
3.16 |
1 |
1.12 |
1.08 |
1.02 |
0.93 | |
|
1 |
0.815 |
1.18 |
- |
1.59 |
- |
2.59 | |
|
2 |
1.296 |
0.98 |
1.59 |
1.14 |
2.59 |
0.76 | |
|
3 |
223 |
1.477 |
1.80 |
1.14 |
1.17 |
0.76 |
0.80 |
|
4 |
2.9 |
1.03 |
1.20 |
1.15 |
3.4 |
1.43 | |
|
5 |
3.326 |
0.94 |
1.15 |
1.49 |
1.43 |
4.49 | |
|
6 |
4.573 |
1.04 |
1.49 |
- |
4.49 |
- | |
|
1 |
0.813 |
1.48 |
- |
1.60 |
- |
2.58 | |
|
2 |
1.297 |
0.88 |
1.60 |
1.14 |
2.58 |
0.73 | |
|
3 |
230 |
1.478 |
1.67 |
1.14 |
1.96 |
0.73 |
5.60 |
|
4 |
2.9 |
0.99 |
1.96 |
1.15 |
5.60 |
1.23 | |
|
5 |
3.324 |
0.82 |
1.15 |
1.49 |
1.23 |
3.53 | |
|
6 |
4.573 |
1.16 |
1.49 |
- |
3.53 |
- | |
Tabel 3. Persentase AUC Puncak Kromatogram Isolat Andrografolid pada Panjang Gelombang 230 nm
|
Fase Gerak |
Rt |
%AUC |
|
0,835 |
1,561 | |
|
1,248 |
0,995 | |
|
Asetonitril 28% dalam air |
1,504 1,993 |
19,846 15,539 |
|
12,530 |
6,577 | |
|
15,313 |
55,480 | |
|
0,821 |
4,039 | |
|
1,294 |
32,894 | |
|
Asetonitril 15% dan metanol-air |
1,477 |
17,902 |
|
(60:40) 85% |
1,730 |
4,317 |
|
2,898 |
22,662 | |
|
3,305 |
18,183 |
Gambar 4. Profil kromatogram isolat androgafolid pada variasi konsentrasi injeksi (keterangan: A = sistem fase gerak asetonitril 28% dalam air, diantaranya A1 = konsentrasi 5 μg/mL, A2 = konsentrasi 10 μg/mL, A3 = konsentrasi 20 μg/mL; dan B = sistem fase gerak asetonitril 15% dan metanol-air (60:40) 85% v/v diantaranya B1 = konsentrasi 5 μg/mL, B2 = konsentrasi 10 μg/mL, B3 = konsentrasi 20 μg/mL)
Pengaruh panjang gelombang (λ) deteksi terhadap kromatogram isolat andrografolid yang mana pada panjang gelombang 190 nm memberikan puncak dengan AUC tertinggi. Hal ini dapat dijelaskan karena ke-6 senyawa memberikan absorptivitas molar yang tinggi pada λ tersebut. Hal yang berbeda didapatkan pada kromatogram dengan λ 230 nm, serapan optimum hanya diberikan oleh senyawa dengan inti andrografolid. Deteksi pada λ 230 nm pada fase gerakasetonitril 28% dalam air, diperoleh 6 puncak, sedangkan pada fase gerak campuran asetonitril 15% dan metanol-air (60:40) 85% diperoleh 6 puncak dengan % AUC 0,995%-55,480%.
Sistem uji kemurnian diharapkan dapat mendeteksi semua komponen senyawa yang ada dalam isolat andrografolid. Pada kedua sistem, deteksi pada λ 210 atau 190 nm memberikan puncak yang lebih detail untuk ke-6 senyawa dalam isolat andrografolid. Permasalahan deteksi pada λ tersebut umumnya adalah pengotor yang bukan dari isolat akan ikut terdeteksi. Sehingga detektor DAD belum dapat membedakan antara pengotor isolat atau pengotor bukan dari isolat. Pengotor yang bukan berasal dari isolat dapat dibedakan jika menggunakan detektot MS.
Senyawa andrografolid memberikan puncak serapan pada 230 nm. Turunan
andrografolid yang telah dilaporkan [Pholphana et al., 2013] memiliki inti kromofor yang sama dengan andrografolid. Puncak 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 memberikan puncak spektrum pada λ 230 nm. Berdasarkan kedekatan gugus kromofor dan bentuk spektrum dari puncak-puncak tersebut dapat diduga bahwa puncak-puncak andrografolid tersebut adalah turunan andrografolid. Deteksi kromatogram pada λ 230 nm mampu menunjukkan turunan andrografolid yang terkandung dalam isolat. Fase gerak asetonitril 28% dalam air memberikan puncak andrografolid yang simetris pada deteksi semua λ. Hal yang sama juga diberikan oleh puncak-puncak turunan andrografolid lainnya. Sistem ini sangat baik digunakan untuk uji deteksi sidik jari kandungan andrografolid dalam isolat.
Uji kemurnian untuk profil sidik jari isolat andrografolid terbaik dilakukan pada panjang gelombang 230 nm dan sistem kromatografi dengan fase gerak asetonitril 28% dalam air.
DAFTAR PUSTAKA
Laksmiani, N. P. L., Susanti, N.M.P., Widjaja, I. N. K., Rismayanti, A. A. M. I., Wirasuta IM.A.G, 2015, Pengembangan metode refluks untuk ekstraksi andrografolid dari herba
sambiloto (Andrographis paniculata
(Burm.f.) Nees), Jurnal Farmasi Udayana, Vol 4 (2):82-90.
Pholphana, N., N. Rangkadilok, J. Saehun, S.
Ritruechai, and J. Satayavivad. 2013.
Changes in The Contents of Four
Active Diterpenoids at Different
Growth Stages in Andrographis
paniculata (Burm.f.) Nees
(Chuanxinlian). Chinese Medicine.
Vol. 8: 1-12.
Warditiani, N.K., Widjaja, I.N.K., Noviyanti,
N. W. R., 2014, Isolasi Andrografolid dari Andrographis paniculata (Burm. f.) Ness menggunakan metode purifikasi dan kristalisasi, Jurnal Farmasi Udayana. Vol 3 (1): 31-34.
29
Discussion and feedback