STUDI IN SILICO CONVERSE REGION ETOPOSITE BINDING DOMAIN Pada ISOZIM HUMAN DNA TOPOISOMERASE II

Cakra Kimia (Indonesian E-Journal of Applied Chemistry)

Volume 4, Nomor 1, Mei 2016

STUDI IN SILICO CONVERSE REGION ETOPOSITE BINDING DOMAIN Pada ISOZIM HUMAN DNA TOPOISOMERASE II

Tirta Setiawan^*1, Laksmi Ambarsari^1,2, Tony Ibnu Sumaryada^2,3

¹Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, 16680

²Pusat Penelitian Biofarmaka, Institute Pertanian Bogor, Jalan Taman Kencana No.3, Bogor

16128

3

³Departemen Fisika, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor,16680

Email: [email protected]¹, [email protected]^1,2, [email protected]^2,3

ABSTRAK: DNA topoisomerase II (Top2) adalah enzim penting yang menangani permasalahan topologi pada DNA. Terdapat dua jenis Top2 pada manusia yaitu Top2A dan Top2B. Top2A diekspresikan pada sel yang aktif membelah seperti sel kanker sedangkan Top2B diekspresikan saat sel dalam fase istirahat. Peran penting inilah yang membuat DNA Top2A menjadi target obat melawan kanker salah satunya obat etoposite. Sisi aktif pengikatan etoposite terhadap Top2B sudah dilakukan namun pada Top2A belum dilakukan. Studi pencarian area yang rapat dengan pensejajaran banyak sekuen pada Top2A dengan Top2B sebagai acuan bertujuan untuk pencarian sisi aktif pengikatan etoposite pada Top2A. Area yang rapat dengan kesamaan residu asam amino yang tinggi dapat digunakan untuk memprediksikan fungsi penting asam amino dalam enzim tersebut. Top2A dan Top2B memiliki kesamaan asam amino sebesar 80% dengan kesamaan struktur 71.81%. Asam amino aktif pengikatan etoposite pada Top2B Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸, dinyatakan mirip dan rapat terhadap residu Gly⁴⁶², Asp⁴⁶³, Arg⁴⁸⁷, Met⁷⁶³ pada Top2A kecuali residu Gln⁷⁷⁸ dari Top2B namun penggantian ini tidak merubah struktur dari enzim tersebut karena sama-sama membentuk struktur alfa-heliks dan terletak pada posisi yang sama sehingga diprediksikan sisi aktif pengikatan etoposite pada enzim Top2B yaitu Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸memiliki fungsi yang sama dengan residu Gly⁴⁶², Asp⁴⁶³, Arg⁴⁸⁷, Met⁷⁶³ dan Met⁷⁶⁷ dari Top2A. Hal ini menyebabkan etoposite juga dapat menghambat kerja enzim Top2A pada residu yang sama.

Keyword: DNA topoisomerase, area yang rapat, Pensejajaran banyak sekuen.

ABSTRACT: DNA topoisomerase II (Top2) is essential enzyme that solves the topological problems of DNA. Top2A and Top2B are two kind of Top2 in human. Top2A is expressed at differentiation active cells as cancer cells whereas Top2B is expressed at non differentiation cells or quiescent cells. Their critical role makes Top2B an attractive drug target against cancer as etoposite known as Top2 inhibitor. Active site for etoposite binding domain to Top2B has been done but in Top2A has not been done yet. Conserve region study by multiple sequence alignment between Top2A and Top2B as Top2B to be a template was aimed to search an active site for etoposite binding domain in Top2A. A conserve amino acid area with highest similarity was

used to predict essential amino acid activity in the enzyme. Homology study shows that Top2A and Top2B have the same similarity of amino acids of 80% with structure similarity of 71.81%. Active amino acids on Top2B for etoposite binding domain such as Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸ were found to be highly conserve with amino acid Gly⁴⁶², Asp⁴⁶³, Arg⁴⁸⁷, Met⁷⁶³ on Top2A except Gln⁷⁷⁸ from Top2B but this does not change of structure of the enzyme because they have the same alfa-helix formations and positions so that it could be predicted that amino acids Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² and Gln⁷⁷⁸ on Top2B have similar activity and function with Gly⁴⁶², Asp⁴⁶³, Arg⁴⁸⁷, Met⁷⁶³ and Met⁷⁶⁷ on Top2A. This etoposite could inhibit the activity of the Top2A enzyme at same site.

Keyword: DNA topoisomerase, Conserve region, Multiple sequence alignment

1.

PENDAHULUAN

Enzim Topoisomerase adalah enzim yang mampu memodifikasi topologi DNA dan berperan aktif dalam proses replikasi, transkripsi dan segregasi kromosom [1]. Sel manusia memiliki dua anggota keluarga Topoisomerase yaitu: Top1 dan Top2. Ada dua isoform Top2 yaitu Top2A dan Top2B. Sehubungan dengan fungsinya pada pembelahan sel, ekspresi Top2A berkaitan erat dengan proliferasi sel. Ekspresi Top2A sedikit pada fase G1, meningkat pada fase S dan fase G2/M, sedangkan ekspresi Top2B relatif konstan selama siklus sel. Top2A khusus diekspresikan pada sel yang sedang berproliferasi dan Top2B pada sel yang tidak berproliferasi atau istirahat [2,3].

Enzim Top2 membutuhkan dua ATP untuk berkerja, sehingga memiliki bagian ATP binding domain. Berdasarkan aktivitasnya enzim ini memiliki sisi katalitik Tyr yang bertugas memotong dan menyambungkan kembali ikatan fosfodiester utas DNA. Selain itu dalam beberapa penelitian, telah dikembangkan beberapa jenis obat yang menargetkan enzim topoisomerase 2 untuk menekan laju proliferasi sel-sel kanker. Mekanisme penghambatannya dibagi dalam dua kategori aktivitas, pertama menyerang domain N-terminal ATPase [4,5]

dan mencegahnya untuk beraktivitas dan meracuni Top2 sehingga menginduksi pemotongan dan mencegah penyambungan kembali DNA [6,7,8].

Etoposite adalah salah satu obat golongan antrasiklin yang berkerja menghambat enzim Top2 dengan kategori aktivitas meracuni Top2. Studi mengenai penggunaanya dapat menghambat kedua jenis enzim Top2 masih belum banyak dilakukan. Walaupun enzim topoisomerase 2A dan 2B merupakan isozim dan mempunyai fungsi spesifik yang sama, namun kedua diekspresikan pada waktu yang berbeda.Pemetaan posisi dan struktur 3D dengan Xray kompleks Top 2B dengan etoposite (PDB ID: 3QX3) telah dilakukan oleh Wu [9] sehingga sudah diketahui binding domain Top 2B dengan etoposite namun untuk Top 2A belum diketahui. Enzim Top 2A lebih banyak diekspresikan pada sel-sel kanker yang aktif membelah. Sel mcf-7 diketahui mengekspresikan enzim Top 2A yang sangat tinggi [10]. Setiap aktifitas tersebut pasti disebabkan oleh adanya peran beberapa residu yang rapat (conserved) pada enzim tersebut yang tentunya penting dan selalu dipertahankan keberadaannya agar tidak hilang atau termutasi. Berubahnya salah residu ini akan mengakibatkan enzim kehilangan aktivitasnya [11]. Untuk mengetahui residu

asam amino yang berinteraksi dengan etoposite pada Top 2A perlu dilakukan analisis lebih lanjut pada kedua enzim.

Bioinformatika atau in silico memiliki potensi yang besar untuk menganalisa dan memprediksikan proses biokimia terutama sekali untuk menentukan hubungan antara struktur dan fungsi biomolekul. Dengan bioinformatika, hubungan residu terhadap struktur dan fungsi dapat diketahui lebih mendalam salah satunya adalah metode homologi protein dan multiple alignment untuk melihat daerah yang conserved.Conserved region dapat digunakan untuk melihat hubungan evolusi antar sekuen, melihat area berulang pada sekuen yang berbeda dapat diprediksikan memiliki struktur yang mirip, jika pada DNA dapat digunakan untuk mencari sekuen regulator dan dapat digunakan untuk menyusun probe atau primer DNA yang dapat digunakan untuk penelitian biologi molekular seperti PCR [12]. Selain itu urutan asam amino khas yang dipertahankan terhadap proses evolusi menunjukkan bahwa asam amino yang rapat (conserved) tersebut memiliki peran penting dan diprediksikan sebagai salah satu sisi aktif [13].

Penelitian ini bertujuan untuk melihat asam amino yang rapat (conserved)etoposite binding domain pada enzim Top 2A berdasarkan template Top 2B yang memiliki kompleks dengan etoposite (3QX3) dengan memanfaatkan metode multiple sequence alignmentbioinformatika.

• 2.    PERCOBAAN

  • 2.1    Penentuan sekuen proteinTop2A dan Top2B

Sekuen protein Top2A dan Top2B diambil dari protein data bank (www.rcsb.org/pdb/) kemudian masing di didownload file berekstensi (.Fasta).

• 2.2    Homologi protein Top2A dan Top2B

Blast dilakukan dengan metode BLASTp, masing-masing file fasta di proses dalam fasilitas Blast (www.uniprot.org/blast)diatur masing-masing dengan target database: UniProtKB, EThreshold: 10, Matrix: Auto, Filtering : None, Gapped: yes dan Hitts: 50.

• 2.3    Analisis daerah aktif (Conserve region)

Hitts yang tertampil dari hasil masing-masing data BLASTp enzim topoisomerase 2A dan topoisomerase 2B di download dalam bentuk file (.fasta) untuk kemudian digabungkan dalam satu file (.fasta). Multiple alignment dilakukan dengan metode ClustalW2 (www.ebi.ac.uk/tools/ msa/clustalw2) kemudian diinput file fasta gabungan tadi. File akan diproses 1 x 24 jam.Publikasi struktur X-ray Top2B yang berkompleks dengan etoposite telah dilakukan oleh Wu et al. (2011) [9]dan dijadikan template untuk melihat asam aminoconsevedyang sama pada Top2A.

Setelah dianalisis conserved region untuk binding domain etoposite pada Top2A, dilakukan superimpose struktur sekunder 3D tiap-tiap residu dengan menggunakan VMD 1.9.1 berdasarkan termplate Top2B yang memiliki kompleks dengan etoposite, untuk melihat posisi residu tersebut berjauhan atau berdekatan.

• 3.    HASIL DAN PEMBAHASAN

Sekuen protein yang digunakan sebagai bahan penelitian adalah sekuen yang berasal dari topoisomerase 2A manusia (Top2A) dengan template topoisomerase 2B (Top2B) berkode PBD ID: 3QX3 yang dipublikasi oleh Wu et al. (2011) dengan struktur kristal X-ray Top2Bberkompleks dengan etoposite. Pemilihan Top2B sebagai template dikarenakan enzim ini memiliki kompleks dengan etoposite karena etoposite merupakan obat antikanker yang bekerja

dengan spesifikasi meracuni Top2, membuat DNA dan Top2 tidak dapat lepas, banyak DNA yang tidak tersambung kembali yang berujung kepada kematian sel.Karena kompleks etoposite-DNA-Top2B sudah berhasil dipetakan, residu yang berinteraksi dengan etoposite juga sudah berhasil dipetakan dengan kode 3QX3_A_AC1_10 (gambar 2) yang dinamai sebagai site recordetoposide binding domain(sisi aktif pengikatan etoposite) pada Top2B dengan residunya yaituGly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸[14]. Kelima asam amino inilah yang kemudian akan disejajarkan dengan Top2A dari manusia untuk dilihat kerapatan(conserve )asam amino.

Conserved region dapat digunakan untuk melihat hubungan evolusi antar sekuen, melihat area berulang pada sekuen yang berbeda dapat diprediksikan memiliki struktur yang mirip, jika pada DNA dapat digunakan untuk mencari sekuen regulator dan dapat digunakan untuk menyusun probe atau primer DNA yang dapat digunakan untuk penelitian biologi molekular seperti PCR [12]. Selain itu daerah yang dipertahankan terhadap proses evolusi evolusi dan semua organisme menunjukkan bahwa residu yang conserved tersebut memiliki peran penting dan diprediksikan sebagai salah satu sisi aktif [13].

Pemilihan Top2A dikarenakan enzim Top2A khusus diekspresikan pada sel yang sedang berproliferasi dan enzim Top2B pada sel yang tidak berproliferasi atau istirahat (quiescent) [2]. Ekspresi enzim Top2A sedikit pada fase G1, meningkat pada fase S dan fase G2/M, sedangkan ekspresi enzim Top2B relatif konstan selama siklus sel. Enzim Top2A ini diketahui memiliki tingkat ekspresi yang tinggi pada sel-sel kanker dan paling tinggi ekspresinya pada kanker Hati (Hep27) dan kanker payudara (mcf-7) [15]. Sel line mcf-7 adalah sel yang diisolasi dari jaringan manusia dan tergolong dalam jenis kanker payudara menunjukkan penurunan drastis tingkat ekspresi top2A ketika diberikan

perlakuan etoposite dan doksorubisin [10]. Enzim Top2 ini merupakan target penting obat kemoterapi golongan antrasiklin seperti etoposite dan doksorubisin.Namundata site record obat dengan enzim Top2A juga belum ada publikasinya sehingga perlu dilakukanmultiple alignmentsequence dan analisisdaerah yang rapat (conserve region) untuk memprediksikan sisi aktif pengikatan etoposite.

Hasil BLASTp dengan Top2B berkode 3QX3 sebagai template ditemukan 250 hasil dengan rincian sebelas isozim Top2 dari manusia dan lebih dari seratus yang diketahui berasal dari 14 spesies organisme yang berbeda (Tabel 1) dan semuanya adalah isozim Top2B tidak terdapat satupun dari jenis Top2A.Top2B dari 14 organisme tersebut terlihat memiliki homologi yang sangat tinggi sehingga diprediksikan memiliki kesamaan asam amino dan struktur.

Tabel 1. Hasil BLASTp Top2B Bukan Manusia Dengan Template Top2B Manusia

Query	Spesies	Homologi %
H2QCW5	Pan troglodytes	99
K7BYJ3	Pan troglodytes	99
G3RAE1	Gorilla gorilla gorilla	99
A0A096P5G9	Papio anubis	99
F7EVK2	Macaca mulatta	99
F7EVJ4	Macaca mulatta	99
H9YVX9	Macaca mulatta	99
G3S3V9	Gorilla gorilla gorilla	99
F6T9B4	Callithrix jacchus	99
F6S0Y0	Callithrix jacchus	99
H2NU77	Pongo abelii	99
O46374	Sus scrofa	98
L9JX05	Tupaia chinensis	98
G1LN78	Ailuropoda melanoleuca	98
G9KUN2	Mustela putorius furo	98
W5PY48	Ovis aries	98
I3NGU9	Spermaphilus tridecemlineatus	98
I3M4Z3	Spermaphilus tridecemlineatus	98
L8IH03	Bos mutus	98
F1MDU7	Bos taurus	98
H0WJ18	Otolemur garnettii	97

Terdapat sebelas isozim Top2 hasil BLASPp asal manusia (Gambar 1) dengan rincian empat enzim Top2A manusia dengan homologi 80% terhadap templatenya Top2B Sedangkan untuk enzim Top2B ditemukan tujuh dengan homologi diatas 90%.Data ini menunjukkan bahwa antara enzim Top2A dan Top2B memiliki perbedaan banyak asam amino. Untuk melihat seberapa jauh perbedaan dan komposisi asam aminonya dilakukan multiple alignment sequence antara Top2A dan Top2B untuk melihat area yang conserve. Namun dua data dengan kode Q59480 dan Q6W6M6 tidak dapat dilakukan alignment karena Match Hits nya berada jauh dari template dan akan berakibat menurunkan ketelitian analisis area yang rapat ketikan menggunakan ClustaW [13].

Dari hasil multiple alignment sequence dengan    menggunakantemplate    Top2B

didapatkan data bahwa active site record etoposite  binding domain pada  Top2B

(gambar 3-5)pada residu  Gly⁴⁷⁸,  Asp⁴⁷⁹,

Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸[14], conserve terhadap residu  Gly⁴⁶²,  Asp⁴⁶³, Arg⁴⁸⁷,

Met⁷⁶³(tanda titik biru diatas menunjukkan asam amino conserve terhadap site record 778 etoposite untuk Top2B).Namun residu Gln⁷⁷⁸ dari Top2B digantikan dengan oleh residu Met⁷⁶⁷. Namun penggantian ini tidak merubah struktur dari enzim tersebut karena sama-sama membentuk struktur alfa-heliks. Residu yang diblok berwana pink (Gambar 3-5) menunjukkan residu yang berperan dalam pembentuka struktur alfa-Heliks, warna coklat berperan dalam pembentukan struktur beta.

Selanjutnya adalah alignment struktur 3D (superimpose)untuk melihat kemiripan bentuk struktur 3D-nya. Pencarian struktur 3D X-ray Top2 pada PDB bank (Tabel 2) didapatkan data bahwa empat enzim Top2A dari hasil BLASTp memiliki struktur 3D Xray pada PBD bank dengan kode PBD 4RIF,

1ZXM, 1ZXN dan 4FM9. Dilihat dari urutan asam aminonya, Top2A berkode 4FM9 satu-satunya yang memiliki kesaman match hits, oleh karena itu digunakan untuk mewakili enzim Top2A untuk dilakukan alignment struktur 3D. Sebelum dilakukan alignment 3D, dilakukan minimisasi energi (www.zhang-lab.org), hal ini bertujuan agar didapatkan konfromasi yang paling stabil. Hasil alignment struktur 3D didapatkan hasil kecocokan antara Top2A dan Top2B adalah sebesar 71.81 %. Nilai QH menunjukkan keidentikan bentuk struktur sekunder antara kedua protein, nilai QH 0.1-0.3 menunjukkan keidentikan yang sangat jauh, nilai QH = 1 menunjukkan sangat identik, nilai QH untuk Top2A dan B adalah 0.7181 sehingga dikatan tidak identik namun terlalu tidak jauh berbeda [16,17]. Komposisi asam amino dari kedua enzim (Tabel 3) menunjukkan jumlah yang berbeda-beda namun memiliki persentase kompoisi yang tidak jauh berbeda, hal ini menunjukan bahwa kedua enzim Top2A dan Top2B adalah Isozim.

Untuk melihat letak residu untuk daerah aktif etoposite antara Top2A dan Top2B, maka dilakukan superimpose struktur dengan menggunakan VMD 1.9.1 dengan fasilitas stamp alignment dan multySeq [18]. Kemudian dilakukan visulisasi antara area yang conserved pada sisi aktif daerah pengikatan etoposite dari keduanya yaitu pada residu Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸dari Top2B dan Gly⁴⁶², Asp⁴⁶³, Arg⁴⁸⁷, Met⁷⁶³ dan Met⁷⁶⁷ dari Top2A. Dari hasil visualisasi terlihat bahwa semua residu terletak pada area dan posisi yang sama (Gambar 7).

Entry

Protein names

Match hit ⅛ 2k ⅛ 4 ⅛'

Identity

Q02880-2

Q02880

B4DKD0

Q71UH4

E9PCY5

P11388-4

P11388-3

P11388-2

P11388

Q59H80

Q6W6M6

Ti Isoform Beta-I of DNAtopotsomerase 2-beta (Homo sapiens)

⅛ DNA topoisomerase 2-beta (Homo sapiens)

DNA topoisomerase 2 (Homo sapiens)

DNA topoisomerase 2 (Homo sapiens)

DNA topoisomerase 2 (Homo sapiens)

⅛ Isoform 4 of DNA topoisomerase 2-alpha (Homo sapiens)

⅛ Isoform 3 of DNA topoisomerase 2-alpha (Homo sapiens)

⅛ Isoform 2 of DNA topoisomerase 2-alpha (Homo sapiens)

⅞ DNA topoisomerase 2-alpha (Homo sapiens)

DNA topoisomerase II, beta isozyme variant (Homo sapiens)

Antigen MLAA-44 (Homo sapiens)

99.0%

99.0%

99.0%

99.0%

100.0%

80.0%

80.0%

80.0%

80.0%

99.0%

97.0%

Gambar 1. Hasil BLASTp Top 2 dengan Top 2B sebagai template pada manusia. (tanda bintang memiliki makna terlah tersedia PDB file)

BINDING SITE FOR RESIDUE EVP A 1 (SOFTWARE)

Gambar 2. Site recorddaerah aktif etoposite binding domain pada topoisomerase 2B yaitu Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸[14].

Q02880-2	T0P2B HUMAN	813	Gkdaaspryiftmlstlarllfpavddnllkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
Q0288Θ	T0P2B HUMAN	818	Gkdaaspriiftmlstlarllfpavddnllkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
B4DKDΘ	B4DKD0 HUMAN	737	Gkdaaspryiftmlstlarllfpavddnllkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
Q71UH4	Q71UH4 HUMAN	790	Gkdaaspryiftmlstlarllfpavddnllkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
E9PCY5	E9PCY5 HUMAN	813	Gkdaaspryiftmlstlarllfpavddnllkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
P11388-4	T0P2A HUMAN	878	Gkdsaspryiftmlsslarllfppkddhtlkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
P11388-3	T0P2A HUMAN	833	Gkdsaspryiftmlsslarllfppkddhtlkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
P11388-2	T0P2A HUMAN	823	Gkdsaspryiftmlsslarllfppkddhtlkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi
P11388	T0P2A HUMAN	797	Gkdsaspriiftmlsslarllfppkddhtlkflyddnqrvepewyipiipmvlingaegi

Gambar 3. Multiple alignment Tyr antara topoisomerase 2A dan 2B

QΘ2880-2	T0P2B HUMAN	453	Gipklddandaggkhslectliltegdsakslavsglgvigrdrygvfplrgkilnvrea
QΘ2880	T0P2B HUMAN	458	Gipklddandaggkhslectliltegdsaks LavsglgvigrdrygvfplrgIil∣vrea
B4DKD0	B4DKD0 HUMAN	377	Gipklddandaggkhslectliltegdsakslavsglgvigrdrygvfplrgkilnvrea
Q71UH4	Q71UH4 HUMAN	430	Gipklddandaggkhslectliltegdsakslavsglgvigrdrygvfplrgkilnvrea
E9PCY5	E9PCY5 HUMAN	453	Gipklddandaggkhslectliltegdsakslavsglgvigrdrygvfplrgkilnvrea
P11388-4	T0P2A HUMAN	518	Gipklddandaggrnstectliltegdsaktlavsglgvvgrdkygvfplrgkilnvrea
P11388-3	T0P2A HUMAN	473	Gipklddandaggrnstectliltegdsaktlavsglgwgrdkygvfplrgkilnvrea
P11388-2	T0P2A HUMAN	463	Gipklddandaggrnstectliltegdsaktlavsglgwgrdkygvfplrgkilnvrea
P11388	T0P2A HUMAN	437	Gipklddandaggrnstectliltegdsaktlavsglgwgi >k∖ ■ pi rg∣il∣vrea

Gambar 4. Multiple alignment residu Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³ antara topoisomerase tipe 2 A dan 2B

Q02880-2	T0P2B HUMAN	753
Q02880	T0P2B HUMAN	758
B4DKD0	B4DKD0 HUMAN	677
Q71∪H4	Q71UH4 HUMAN	730
E9PCY5	E9PCY5 HUMAN	753
P11388-4	T0P2A HUMAN	S18
P11388-3	T0P2A HUMAN	773
P11388-2	T0P2A HUMAN	763
P11388	T0P2A HUMAN	737

Ndkrevkvaqlagsvaemsayhhgeqalmmtivnlaqnfvgsnninllqpigqfgtrlhg NdkrevkvaolagsvaemsayhhgeqalmmtivnLaonfvgsnninllqpigqfgtrlhg Ndkrevkvaqlagsvaemsayhhgeqalmmtivnlaqnfvgsnninllqpigqfgtrlhg Ndkrevkvaqlagsvaemsayhhgeqalmmtivnlaqnfvgsnninllqpigqfgtrlhg Ndkrevkvaqlagsvaemsayhhgeqalmmtivnlaqnfvgsnninllqpigqfgtrlhg Ndkrevkvaqlagsvaemssyhhgemslmmtiinlaqnfvgsnnlnllqpigqfgtrlhg Ndkrevkvaqlagsvaemssyhhgemslmmtiinlaqnfvgsnnlnllqpigqfgtrlhg Ndkrevkvaqlagsvaemssyhhgemslmmtiinlaqnfvgsnnlnllqpigqfgtrlhg ndkrevi<vaqlag≤vaemsξ∣hhgem∣lmmtiinlaqnfvgsnnlnllqpigqfgtrlhg

Gambar 5. Multiple alignment residu Met⁷⁸², dan Gln⁷⁷⁸antara topoisomerase tipe 2A dan 2B

Tabel 2. Hasil Pencarian Struktur 3D X-Ray Kristal Top2A dan Top2B.

Enzim	Query	PDB	Nomor residu	Kompleks
				DNA	Ligand
Topoisomerase II A	P11388-4	4RIF	29-428	-	ADP & SO4
	P11388-3	1ZXM	29-428	-	AMP-PNP
	P11388-2	1ZXN	29-428	-	ADP
	P11388	4FM9	431-1193	YA	Gliserol
Topoisomerase II B	Q02880	3QX3	459-1206	YA	Etoposite
	Q02880-2	4G0U	450-1212	YA	Amsacrin
	E9PCY5	-	450-1212	YA	Mitosantron
	Q71UH4	-	450-1212	YA	Ametantron

B.

Gambar 6. A) superimpose struktur 3D Top2A dengan template Top2B, warna biru (kesamaan residu) dan warna merah (perbedaan residu), B). indeks alignment dari tools multi sekuen menggunakan VMD 1.8.1. dan lingkaran hijau menandakan perbedaan struktur yang sangat nyata.

Tabel 3. Perbandingan Komposisi Asam Amino Pada 3qx3 (Top2B) Dengan 4fm9 (Top2A).

No

Asam amino

Simbol

Singkatan

Jumlah 3qx3 4fm9

Klasifikasi

Persentase (%) 3qx3  4fm9

1 Alanin	Ala	A	49	31
2 Valin	Val	V	41	37
3 Leusinsin	Leu	L	76	81	Asam amino
4 Isoleusin	Ile	I	49	49	dengan    38.605 38.0079
5 Prolin	Pro	P	30	32	Gugus -R
6 Fenilalanin	Phe	F	33	29	tak mengkutub
7 Triptofan	Trp	W	12	11
8 Metionin	Met	M	20	20
9 Glisin	Gly	G	50	44
10 Serin	Ser	S	48	44	Asam amino
11 Treonin	Thr	T	39	43	dengan
12 Sistein	Cys	C	5	6	Gugus -R   30.012 30.2752
13 Tirosin	Tyr	Y	27	28	mengkutub
14 Aspargarin	Asn	N	39	40	tak bermuatan
15 Glutamin	Gln	Q	33	26
16 Asam aspartat	Asp	D	55	47	„              .        '            f Asam amino sam am no 14.446 15.3342
17 Asam glutamat	Glu	E	61	70	R Negatif
18 Lisin	Lys	K	72	74	Asam amino
19 Arginin	Arg	R	35	36	Basa      16.936 16.3827
20 Histidin	His	H	29	15
Total Asam amino			803	763

Gambar 7. A) superimpose Top2A dan B (subunit A), B) Met⁷⁸², C) Gln⁷⁷⁸, D) Gly⁴⁷⁸, E) Asp⁴⁷⁹, F) Arg⁵⁰³ dan G) Tyr ⁸²⁶.

A.

Selain sisi aktif untuk pengikatan etoposite, enzim Top2 juga memiliki daerah aktif yang berfungsi memotong ikatan fosfodiester utas DNA yang dilakukan oleh residu Tyr⁸²⁶ (Wu et al. 2011) pada top2B, dan dari hasil multiple alignment sequence, conserve region serta visualisasi, Top2A juga memiliki residu Tyr⁸⁰⁵ yang conserve terhadap

residu Tyr⁸²⁶ pada Top2B (Gambar 3) dengan posisi yang sama (Gambar7). Dari penelitian ini maka dapat dikatakan bahwa sisi aktif pengikatan etoposite pada enzim Top2B yaitu Gly⁴⁷⁸, Asp⁴⁷⁹, Arg⁵⁰³, Met⁷⁸² dan Gln⁷⁷⁸diprediksikan memiliki fungsi yang sama dengan residu Gly⁴⁶², Asp⁴⁶³, Arg⁴⁸⁷, Met⁷⁶³ dan Met⁷⁶⁷ dari Top2A. Sehingga

etoposite juga dapat menghambat kerja enzim Top2A pada residu yang sama.

• 4.    UCAPAN TERIMAKASIH

Terimakasih      kepada      kepala

laboratorium Mikrobiologi PSSP (pusat studi satwa primata), seluruh staf pengajar Departemen Biokimia MIPA IPB dan komunitas online Research gate yang telah memberikan solusi pada forum tanya jawabnya.

DAFTAR PUSTAKA

• [1]    Nitis JL, Beck WT. 1996, “Antitopoisomerase drug action and resistance”, Eur J Cancer. 10: 68-75.

• [2]    Fry AM, Chresta CM, Davies SM. 1991, “Relationship between topoisomerase II level and chemosensitivity in human tumor sell lines”, Cancer Res. 51: 65926595.

• [3]    Bauman ME, Holden JA, Brown KA, Harker WG,  Perkins SR. 1997,

”Differenttial     immunohistochemical

staining for DNA topoisomerase IIA and B in human tissue and for DNA topoisomerase IIB in non Hodkin limphoma”, Mod Pathol. 10: 168-175.

• [4]    Baird CL, Gordon MS, Andrenyak DM, Marecek JF, Lindsley JE. 2001,”The ATPase reaction cycle of yeast DNA topoisomerase II: slow rates of ATP resynthesis and Pi release”, J Biol Chem. 276: 27893-27898.

• [5]  Robinson HM, Bratlie-Thoresen S,

Brown R, Gillespie DA. 2007,”Chk1 is required for G2/M check-point response induced by the catalitic topoisomerase II inhibitor ICRF-1993”, Cell Cycle. 6: 1265-1267.

• [6] Chow KC, Macdonald TL, Ross WE.

1998, “DNA binding by epipodophyllo-toxins and N-acyl antracyclines: Implications for mechanism of

topoisomerase     inhbition”,     Mol.

Pharmacol. 34: 467-473.

• [7]    Osheroff N. 1989, “Effect of antineoplastic agent on the DNA cleavage/religation equlibrium of eukariotic topoisomerase II: inhibition of DNA religation by etoposide”, Biochemistry. 28: 6157-6160.

• [8]    Beck LS, Deguzman L, Lee WP, Xu Y, Siegel MW, Amento EP. 1993,”One systemic administration of transforming growth factor-beta 1 reverses age or glucocorticoid    impaired    wound

healing”, J Clin Invest. 92: 2841-2849.

• [9]    Wu CC, Li TK, Far HL, Lin LY, Lin TS, YU YJ, Ten TJ, Chiang CW, Chan NL. 2011, ”Structural basis of type II topoisomerase inhibition by the anticancer drug etoposite”, J science. 333: 459-462.

• [10]    Kaplan E, Gunduz U. 2011, “Expression analysis of TOP2A, MSH2 adn MLH1 genes in MCF7 cells at different levels of etoposite resistance”, Eur J Pharm. 66: 29-35.

• [11]    Nelson D, Cox M. 2008. Principle of Biochemistry (5^th Edn.). W.H. freeman and company, USA. ISBN-13: 978-07176-7108-1.

• [12]    Mount DW. 2004. Bioinformatics sequences and genome analysis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

• [13]    Baxevanis AD, Ouellette BF. 2001. Bioinformatics A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins Second Edition. 1-457.

• [14]    Golovin A, Dimitropolos D, Oldfield T, Rachedi A, Henrick K. 2005. MSDsite: a data base search and retrieval system for the analysis and viewing of bound ligands and active site. Protein. 58: 190199.

• [15]    AbuHammad S, Zihlif M. 2012, “Gene expression alteration in doxorunicin resistant MCF-7 breast cancer cell line”, Genomic. 101: 213-220.

• [16]    Thompson JD. 1994, “CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res. 22: 4673–4680.

• [17]    Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettingan PA, Mc

William H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. 2007, clustal w and clustal x version 2.0. Bioinformatic. 23: 2947-2948.

• [18]    Russell RB, Breed J, Barton GJ. 1992, “Conservation analysis and secondary structure prediction of the sh2 family of phosphotyrosine binding domains”, Proteins: Struct., Funct., Genet. 304, 15-20.

70